参苓白术散与痛泻要方对溃疡性结肠炎大鼠内源性间充质干细胞动员的比较研究

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

刘喜平,崔国宁,董俊刚,曾庆涛甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000

摘要:目的 比较参苓白术散与痛泻要方对溃疡性结肠炎大鼠内源性间充质干细胞(MSCs)动员作用的

影响。方法 20 只 SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、参苓白术散组和痛泻要方组,TNBS/乙醇法建立溃疡性结肠炎模型。各给药组给予参苓白术散与痛泻要方灌胃,空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃。灌胃结束后,提取外周血与骨髓 MSCs 进行原代培养,流式细胞术检测骨髓与外周血来源 MSCs。结果 骨髓来源MSCs:与空白组比较,模型组阳性细胞百分数明显下降(P<0.05);与模型组比较,参苓白术散组、痛泻要方组阳性细胞百分数明显升高,参苓白术散组优于痛泻要方组(P<0.05)。外周血来源MSCs:与空白组比较,

模型组阳性细胞百分数明显升高(P<0.05);与模型组比较,参苓白术散组、痛泻要方组阳性细胞百分数明显

下降,参苓白术散组优于痛泻要方组(P<0.05)。结论 参苓白术散和痛泻要方均具有促进模型大鼠骨髓来源MSCs增多、外周血来源MSCs减少作用,且参苓白术散优于痛泻要方。关键词:溃疡性结肠炎;间充质干细胞;参苓白术散;痛泻要方;大鼠DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.010中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)11-0041-05 Comparative Study on Mobilization of Endogenous MSCs in Treatment of Ulcerative Colitis Rats by Shenling Baizhu Powder and Tongxie Yaofang Decoction LIU Xi-ping, CUI Guo-ning, DONG Jun-gang, ZENG Qing-tao Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China Abstract: Objective To compare mobilization effects of endogeneous MSCs in the treatment of ulcerative colitis rats by Shenling Baizhu Powder and Tongxie Yaofang Decoction. Methods Twenty SD male rats were randomly divided into blank group, model group, Shenling Baizhu Powder group and Tongxie Yaofang Decoction group. TNBS/ethanol method was used to build the ulcerative colitis model. Administration groups were given Shenling Baizhu Powder and Tongxie Yaofang Decoction for gavage and model group and blank group were given normal saline for gavage. After gavage, MSCs from peripheral blood and bone marrow were extracted for primary culture. MSCs of bone marrow and peripheral blood were detected by flow cytometry. Results MSCs from bone marrow showed: Compared with the blank group, the percentage of positive cells in the model group decreased (P<0.05); Compared with the model group, the percentage of positive cells in Shenling Baizhu Powder group and Tongxie Yaofang Decoction group increased, and the expression of Shenling Baizhu Powder group was more obvious (P<0.05). MSCs from peripheral blood showed: Compared with the blank group, the percentage of positive cells in the model group increased (P<0.05); Compared with the model group, the percentage of positive cells in Shenling Baizhu Powder group and Tongxie Yaofang Decoction group decreased, and the expression of Shenling Baizhu Powder group was more obvious (P<0.05). Conclusion Shenling Baizhu Powder and Tongxie Yaofang Decoction have the function of promoting the increase of bone marrow-derived MSCs and the reduction of peripheral blood source of MSCs in model rats, and Shenling Baizhu Powder is better than Tongxie Yaofang Decoction. Keywords: ulcerative colitis; MSCs; Shenling Baizhu Powder; Tongxie Yaofang Decoction; rats

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种免疫性疾病,是由多种因素引起的肠道系统炎症疾病。目前治疗主要是抑制炎症,包括药物、生物抑制剂、手术切除炎症性肠部等手段,但这些治疗方法都具有复发的局限性,其病情易于反复,迁延难愈。有研究表明,结肠黏膜干细胞位于结肠隐窝内,数量很少,其对损伤结肠黏膜具有修复与重建作用,UC 过程中结肠黏膜弥漫性损害,数量很少的结肠黏膜干细胞进一步减少,而减少的结肠黏膜干细胞可能是其迁延难愈的病因[1],补充足够的结肠黏膜干细胞可能是治疗UC的关键。研究发现,骨髓间充质干细胞(MSCs)具有向受损结肠黏膜迁移、归巢的特性,可分化为结肠黏膜干细胞,MSCs 迁移到受损的结肠黏膜数量要高于正常结肠黏膜[2]。然而 MSCs主要来源于骨髓,在 UC过程中,内源性MSCs是否动员进入外周血?治疗UC的常用方剂参苓白术散与痛泻要方对内源性MSCs 动员特性影响有何不同?本研究观察参苓白术散与痛泻要方对UC大鼠模型内源性MSCs动员作用的影响,同时以“以方测证”探讨TNBS/乙醇法建立UC大鼠模型中医证候类型,为临床中医药参与MSCs治疗UC提供依据。1 实验材料1.1 动物SD雄性大鼠 20 只,SPF 级,体质量 180~220 g,重庆腾鑫生物技术有限公司提供,动物许可证号

SCXK(军)2012-0011。饲养于温度 23~25℃、相对湿度 40%~60%、12 h/12 h昼夜交替环境,自由摄食

饮水。

1.2 药物及制备参苓白术散(麸炒白术、山药、茯苓、白参各15 g,白扁豆 12 g,莲子肉 10 g,麸炒薏苡仁各 10 g,砂仁、

桔梗各6g,炙甘草9g)与痛泻要方(麸炒白术、麸

炒山药各 12 g,防风 6 g,陈皮 9 g),饮片购于甘肃中医药大学附属医院中药房。按原方比例将上述二方药物饮片分别浸泡30 min,煎煮 2 次,第1 次加8倍水,煎煮 1 h,取煎液,第 2 次加6倍水,煎煮 30 min,

取煎液,2 次煎液混合,浓缩,按大鼠与人体剂量换算,参苓白术散浓缩为含原药材 2.26 g/mL,痛泻要方浓缩为含原药材 0.78 g/mL。

1.3 主要试剂与仪器5%TNBS(美国 Sigma,S9951),DMEM-F12 培养基(美国 Gibco,HLM150312),胎牛血清(美国

Gibco,HLC0101),胰蛋白酶(中国 Beyotime,ST505),

青/链霉素溶液(100X,中国 Beyotime,C0222),台

盼蓝粉末(美国 Sigma,HZB0368),淋巴细胞分离液(中国 TBD , D-5879 ), Rat CD29-PE (美国

eBioscience,12-0291-81),IgG-PE(美国 eBioscience,

12-4714-71 ), Rat CD45-PE-Cyanine5.5 (美国

eBioscience,35-0459-42),IgG1-PE-Cyanine5.5(美

国,eBioscience,35-0567-41),一抗 Anti CD29(兔

来源,美国 Abcam,AB6776)、Anti CD105(鼠来源,

美国 Abcam,AB21222),二抗 Anti FITC(抗兔,美

国 Abcam,AB6743)、Anti Cy3(抗兔,美国 Abcam,

AB6939)。流式细胞检测仪(美国 BD,FACSVantage

SE),电子分析天平(Precisa12A,瑞士,XB220A),

烤片机(德国 Leica,HI1220),切片机(德国 Leica,

CM1520),展片机(德国 Leica,VT1200S),电热压力蒸汽消毒器( XDD ,浙江绍兴医疗器械总厂,

YXQ-LS-100A),电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医

疗器械厂,GZX-914MBE),高速台式离心机(湘仪

离心机仪器有限公司,TGL16-WS),CO2培养箱(日

本三洋, MCO-15AC-SC ),倒置显微镜(日本OLYMPUS,ECLIPSE Ti-s),0.22 μm混合纤维素滤

膜(美国 MILLIPORE,GSWP04700),80/200 目不

锈钢细胞筛(上海生工,F513440-0001),细胞培养

瓶及培养板(美国 Costar,3599、3099),纯水仪(美

国 MILLIPORE,ELIX3)。

2 实验方法2.1 造模、分组及给药实验大鼠常规适应性饲养1周后,随机抽取6只

作为空白组,余下全部造模。7%水合氯醛(200 g/mL)大鼠腹腔注射麻醉。石蜡油润滑经肛门缓插输液管至距肛门8 cm处,每 200 g大鼠予 5%TNBS 0.4 mL,

将 100 mg/kg TNBS与等体积50%乙醇混合共0.8 mL,

再注入 0.5 mL空气,将大鼠头朝下倾斜 45°放置

1 min,平躺待自然醒,每周 1 次,连续 5 周。造模结束后,各组随机抽取大鼠2只,迅速脱颈处死,剖腹,取全部结肠,平分2段,沿肠系膜缘剪开肠腔,

PBS 冲洗 2 遍,4%多聚甲醛固定 24 h,石蜡包埋,

切片(厚约 4 μm),HE 染色观察大鼠结肠黏膜组织病理学变化,并与空白组比较,评价造模成功与否[3]。将成模大鼠随机分为模型组、参苓白术散组和痛泻要方组,各给药组分别予参苓白术散与痛泻要方药液灌胃,空白组和模型组予等量生理盐水灌胃。给药体积2 mL/200 g,每日 1次,共 28 d。2.2 大鼠外周血来源间充质干细胞分离培养、鉴定灌胃结束后,水合氯醛麻醉,无菌条件下切开腹腔并暴露腹主动脉,采血针内加入1000 U肝素抗凝,

培养基稀

腹主动脉采血释后,加到含5 5 mL mL,用等量无血清Ficoll-Paque Plus DMEM液离心管,用密

度梯度离心法分离单个核细胞,2000 r/min 离心20 min,收集交界面单个核细胞,PBS冲洗,1000 r/min 离心

5 min,重复 3 次,用含体积分数为 10%胎牛血清DMEM培养基按 106/mL 密度将单个核细胞重悬,将

单个核细胞悬液按每瓶 4 mL 接种于 25 cm2 培养瓶

中,于 37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。将消

毒盖玻片置于6孔板中,加 0.1 mg/mL 多聚赖氨酸后

放入 37 ℃孵箱中孕育1 h,取出 6孔板,回收多聚赖氨酸,PBS冲洗 3遍,并用紫外灯照射过夜备用。胰蛋白酶消化后,完全培养基重悬细胞,将细胞悬液平均转移至铺有盖玻片6孔板中,每孔添加培养基至

2 mL,待细胞长满6孔板底90%后,免疫荧光检测。

实验重复3次。2.3 大鼠骨髓来源间充质干细胞分离培养、鉴定常规手术消毒,无菌条件下解剖分离,摘除双侧股骨,剔除骨表面肌肉及组织,从一端剪开骨髓腔,用预先抽入无血清 DEME 培养基的注射器冲洗骨髓腔,70 mm网筛过滤,将冲洗液收集入无菌平皿中。

将平皿中液体移入50 mL 离心管中,1000 r/min 离心

5 min,弃上清液,用培养液5 mL重悬细胞,然后加

到含 5 mL Ficoll-Paque Plus液离心管内,用密度梯度

离心法分离单个核细胞,2000 r/min 离心 20 min,收集交界面中间细胞,PBS 冲洗,1000 r/min 离心 5 min,

重复 3次,用含体积分数为10%胎牛血清 DMEM 培养基按 106/mL 密度将单个核细胞重悬,将单个核细胞悬液按每瓶4 mL接种于 25 cm2培养瓶,于 37 ℃、

5%CO2 及饱和湿度条件下培养。鉴定方法同“2.2”项。2.4 流式细胞仪检测骨髓及外周血来源间充质干细胞分别收集 1×106 分离大鼠骨髓与外周血来源的MSCs,加入 1 mL 预冷 PBS 重悬细胞,再离心沉淀细胞,弃去上清液,可残留约50 μL PBS,轻轻弹击离心管底部分散细胞,避免细胞成团。各组加入5 μL CD29/PE 与 CD45/PC5.5 抗体,并轻轻混匀,同时设置同型对照与空白组管。4 ℃冰箱避光孵育 20 min后加入 200 μL Staining Buffer,4 ℃、1000 r/min 离心5 min,弃去上清液,洗 3 次,100 μL重悬细胞后流式细胞仪检测。3 统计学方法采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s — 表示,多组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。 4 结果

4.1 病理变化空白组大鼠结肠组织黏膜结构清晰,黏膜完整而无缺损,黏膜上皮细胞排列整齐,无炎性细胞浸润,固有层可见毛细血管与淋巴管细胞,杯状细胞比较丰富,排列整齐,肠腺比较规则;模型组大鼠结肠组织杯状细胞严重变形,结肠黏膜缺失明显,固有层腺体多数表现为不完整,杯状细胞减少,部分细胞出现坏死,结肠黏膜炎性损伤,并有大量炎性细胞浸润,符合 UC病理组织特征,表明TNBS/乙醇诱导 UC大鼠模型成功建立;参苓白术散组和痛泻要方组大鼠结肠组织黏膜上皮细胞排列比较整齐,炎性细胞浸润明显减少。结果见图1、图 2。 图 2 各组大鼠结肠组织形态观察(HE染色,×400) 4.2 外周血及骨髓间来源充质干细胞形态变化刚接种的细胞形态主要表现为椭圆形与圆形不等细胞,细胞密集地悬浮于培养液中,折光性比较强,培养 3d后,部分细胞呈现类圆形或纺锤形,培养液中仍有大量未贴壁细胞悬浮,第1代细胞表现为:细胞贴壁生长,细胞呈现纺锤形、不规则形、三角形或

多边形等多种形态,细胞融合范围80%~90%,而悬浮于培养液中混杂细胞较少。可见镜下骨髓来源

MSCs 密集程度明显多于外周血来源 MSCs 密集程度,提示骨髓来源 MSCs 数量多于外周血来源 MSCs数量。结果见图3、图 4。 4.4 骨髓及外周血来源间充质干细胞流式细胞仪检测结果

骨髓来源 MSCs:与空白组比较,模型组阳性细胞百分数明显下降(P<0.05);与模型组比较,参苓白术散组和痛泻要方组阳性细胞百分数均明显升高,参苓白术散组优于痛泻要方组,差异有统计学意义

(P<0.05)。外周血来源:与空白组比较,模型组阳

性细胞百分数升高,差异有统计学意义(P<0.05); 与模型组比较,参苓白术散组、痛泻要方组阳性细胞百分数下降,参苓白术散组优于痛泻要方组,差异有

统计学意义(P<0.05)。结果见图 6、图 7 和表1。 5 讨论

在低氧诱导因子 1α 高表达对心肌梗死大鼠MSCs动员研究中,给予低氧诱导因子1α错义寡核苷酸组外周血 MSCs 数量较给予低氧诱导因子 1α 反义寡核苷酸组高,提示低氧诱导因子 1α 高表达与骨髓来源 MSCs动员、起到一系列心肌组织自我修复等过程有关[4],说明在病理状态下,骨髓来源 MSCs 可动员进入外周血,进行受损组织的修复,这与Koning J J等[5]研究骨髓来源 MSCs炎症条件下可动员到远处受

损组织发挥修复作用具有一致性。临床研究表明,在脑梗死治疗中增加活血化瘀药物可提高疗效[6],三七总皂苷为三七提取物之一,有活血化瘀的功效。研究发现,三七总皂苷可通过促进骨髓中干细胞因子表达,降低 CD54、CD106 表达,从而促进骨髓来源MSCs动员进入外周血,提高归巢细胞数[7]。

UC 属中医学“腹痛”“肠癖”“泄泻”等范畴,病因主要与外感病邪、情志损伤、饮食不节等相关。湿热蕴肠、气机壅滞是基本病机。活动期主要以湿热蕴肠、邪实阻滞为主,缓解期以本虚标实为主,主要表现为脾虚湿盛、正虚邪恋、病情迁延。方证相关是经方临床长期治疗过程中总结出来的治疗理念,《伤寒论》主要以方证对应来指导临床辨治[8]。依据方证相关,参苓白术散与痛泻要方是治疗UC的基本方剂,且临床疗效得到了肯定[9-10]。我们研究发现,在 UC过程中参苓白术散与痛泻要方均有促进骨髓来源

MSCs 增多、外周血来源 MSCs 减少的作用,参苓白术散促进作用优于痛泻要方,表明本实验所选模型可能为中医脾虚湿盛证模型。在骨髓中,模型组 MSCs较空白组减少,说明 UC 过程可促进骨髓来源 MSCs动员进入外周血。在外周血中,与空白组比较,模型组 MSCs增多,而给药组MSCs数量少于模型组,我们推测在二方干预治疗下,外周血MSCs 减少,其可能已经迁移并归巢到结肠黏膜进行受损结肠黏膜的修复。中医认为“脾胃为后天之本,气血生化之源”,而精气血津液又可互化,参苓白术散益气健脾、渗湿止泻,痛泻要方补脾柔肝、祛湿止泻,二方具有扶正

祛邪之功。UC 病机主要为湿邪偏盛,祛除湿邪符合UC 的病证治疗,同时二方补脾,脾胃为人体气血生化之源,通过补脾可达到启化源、滋营卫、益气血、补脏腑、祛病邪。人体精、气血、津液可互化,肾主藏精,主骨生髓,而MSCs 主要存在于骨髓中[10],其

在特定的条件下可向多个胚层细胞分化[11]。采用中医药对UC进行对证治疗,可促进骨髓来源MSCs增多,外周血来源 MSCs减少,这为内源性MSCs 动员机制研究提供参考依据。对于动员进入外周血中MSCs 是如何迁移并定植分化为结肠黏膜干细胞从而发挥治疗作用,外周血微环境对MSCs产生怎样的影响,需进一步研究。

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(收稿日期:2018-03-12)

(修回日期:2018-04-15;编辑:华强) 开放科学(资源服务)标识码(OSID)内含全文PDF和增强文件

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