基于 CXCR4启动子的中药有效成分高通量筛选细胞模型构建和应用

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 - 基金项目:国家自然科学基金青年基金(81303300、81703763); 国家自然科学基金面上项目(81673729);上海中医药大学 预算内项目(2015YSN04) 通讯作者:王莹,E-mail:[email protected]

王强利1,国海东1,王奕1,吴心语1,赵亮 2,王莹 3

1.上海中医药大学基础医学院,上海 201203;2.上海东方肝胆外科医院,上海 200438;

3.上海中医药大学中药学院,上海 201203

摘要:目的 以 CXCR4基因启动子为靶点,建立促干细胞归巢药物筛选细胞模型,并对中药单体进行筛

选。方法 将人 CXCR4 基因启动子序列(279 bp)插入荧光素酶报告基因载体 pGL4.17-Basic 中,构建重组

质粒 pGL4.17-CXCR4,与内参质粒 pRL-TK 共转染 293 细胞,经验证 CXCR4 启动子转录活性后,单细胞克

隆培养以获得稳转细胞株,并用于候选中药单体1~10的筛选,最后应用 Western blot验证所筛选出的中药单体促进间充质干细胞(MSCs)中 CXCR4表达的作用。结果 成功建立药物筛选细胞模型,筛选出候选单体6提高 CXCR4 启动子活性的作用最强,Western blot结果证实候选单体6可明显促进 MSCs 中 CXCR4 的表达。结论 本研究建立的药物筛选细胞模型能实现对潜在促进干细胞归巢中药有效成分的高通量筛选。关键词:心肌梗死;干细胞移植;CXCR4/SDF-1轴;荧光素酶报告基因;细胞模型DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.012中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)11-0052-05 Establishment and Application of High-throughput Screening Model for Active Ingredients of Traditional Chinese Medicine Based on CXCR4 Promoter WANG Qiang-li1, GUO Hai-dong1, WANG Yi1, WU Xin-yu1, ZHAO Liang2, WANG Ying3

1. School of Basic Medical Sciences, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China;

2. Shanghai Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Shanghai 200438, China;

3. School of Pharmacy, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Abstract: Objective To establish a cell model targeting the CXCR4 gene promoter to screen of drugs potentially promoting the stem cell homing, and to screen the monomers of traditional Chinese medicine. Methods The human CXCR4 gene promoter sequence (279 bp) was inserted into the luciferase reporter vector pGL4.17-Basic to construct the recombinant plasmid pGL4.17-CXCR4, which was co-transfected with the internal reference plasmid pRL-TK into 293 cells. After verifying transcriptional activity of CXCR4 promoter, single cell clones were cultured to obtain a stable transfectant cell line and used for screening of candidate Chinese herbal monomer (1 to 10). Finally, Western blot was used to verify the effect of the selected Chinese herbal monomer on the expression of CXCR4 in MSCs.

Results The drug screening cell model was successfully established and the candidate monomer 6 was screened out because of the strongest effect on enhancing CXCR4 promoter activity. Western blot results verified that the candidate monomer 6 could promoted the expression of CXCR4 of MSCs. Conclusion The drug screening cell model established in this study was able to achieve high-throughput screening for potentially promoting the stem cell homing Chinese herbal monomer.

Keywords: myocardial infarction; stem cell transplantation; CXCR4/SDF-1 axis; luciferase reporter gene; cell model 心肌梗死(myocardial infarction,MI)后进行性心力衰竭是现代心脏病学的巨大挑战。通过移植自体或异体间充质干细胞( mesenchymal stem cell , MSCs)能增强心脏功能,缩小梗死面积,延缓心衰进程[1]。然而,移植后 MSCs较低的心脏留存率严重

影响了其治疗效果。研究显示,静脉注射后仅有 2%

的干细胞归巢至心脏,冠脉注射为15%,直接注射到

心肌内仅有11%的留存率,大部分细胞分散在肺、肝和脾[2]。因此,促进移植后更多的干细胞向 MI 区归巢是增强 MSCs 治疗 MI作用的关键。CXC趋化因子

受体 4[chemokine(C-X-C motif) receptor 4,CXCR4]

和其配体基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived

factor-1α,SDF-1α)在 MSCs 归巢中发挥主要作用[3]。CXCR4是7次跨膜的G蛋白偶联受体,通过与SDF-1特异性结合介导 MSCs 迁移、增殖和分化[4]。研究发

现,提高 MSCs 表达 CXCR4 水平能增强细胞迁移和向 MI 区域归巢的能力[5] ,使用 CXCR4 阻断剂AMD3100 可明显抑制干细胞向MI区域归巢,使归巢的细胞数量显著减少[6]。因此,以 CXCR4 表达水平为考察对象,筛选能促进MSCs归巢中药单体,对于增强MSCs的治疗作用和阐明中药治疗心血管疾病的机制都具有十分重要的意义。据此,本研究构建了含CXCR4 启动子的双荧光素酶报告系统的药物高通量筛选模型,并验证该细胞模型的可靠性。1 实验材料

1.1 动物

雄性 SD 大鼠,体质量(200±20)g,上海中医药大学实验动物中心,动物许可证号 SYXK(沪) 2014-0008。饲养于上海中医药大学 SPF 级动物房,自由摄食饮水。1.2 细胞株293人胚肾上皮细胞为本实验室培养。

1.3 药物

人参皂苷 Rb1 和 10 种候选中药单体均购自上海融禾医药科技发展有限公司。1.4 主要试剂与仪器荧光素酶报告载体 pGL4.17、海肾荧光素质粒pRL-TK,优宝生物;限制性内切酶 Xhol、Hind Ⅲ和T4 DNA连接酶,东洋纺(上海)生物科技有限公司; SuperFectin Ⅱ脂质体转染试剂,上海普飞生物技术有限公司;感受态大肠杆菌 DH5α、普通质粒小提试剂盒、胰蛋白胨、琼脂糖及酵母提取物,天根生化试剂有限公司;G418、转化生长因子-β1(TGF-β1),上海翊圣生物科技有限公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒,Promega 公司;DMEM培养基、胎牛血清、青-链霉素、细胞培养瓶和培养板,Corning 公司;兔抗人多克隆、抗体 GAPDH、CXCR4 和 HRP 标记羊抗兔二抗,Proteintech 公司。酶标仪(Synergy 2,BioTek公司),荧光活体成像系统(Lumina XR,PerkinElmer

公司),化学发光成像分析系统(Tanon 5200,天能)。2 实验方法2.1 CXCR4启动子的合成

参考 Wegner S A 等[7]报道 CXCR4 启动子DNA,

设计一对互补序列,标记为 CXCR4-F/R,5'端引入酶

切位点 Xhol,3'端引入酶切位点 Hind Ⅲ。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成,DNA序列如下。

CXCR4-F:5'-CTCGAGTACCGACCACCCGCAAAC AGCAGGGTCCCCTGGGCTTCCCAAGCCGCGCAC CTCTCCGCCCCGCCCCTGCGCCCTCCTTCCTCGC GTCTGCCCCTCTCCCCCACCCCGCCTTCTCCCTC CCCGCCCCAGCGGCGCATGCGCCGCGCTCGGAG CGTGTTTTTATAAAAGTCCGGCCGCGGCCAGAA ACTTCAGTTTGTTGGCTGCGGCAGCAGGTAGCA AAGTGACGCCGAGGGCCTGAGTGCTCCAGTAGC CACCGCATCTGGAGAACCAGCGGTTACCAAGCT

T-3';CXCR4-R:5'-AAGCTTGGTAACCGCTGGTTC TCCAGATGCGGTGGCTACTGGAGCACTCAGGCC CTCGGCGTCACTTTGCTACCTGCTGCCGCAGCCA ACAAACTGAAGTTTCTGGCCGCGGCCGGACTTT TATAAAAACACGCTCCGAGCGCGGCGCATGCGC CGCTGGGGCGGGGAGGGAGAAGGCGGGGTGGG GGAGAGGGGCAGACGCGAGGAAGGAGGGCGC AGGGGCGGGGCGGAGAGGTGCGCGGCTTGGGA AGCCCAGGGGACCCTGCTGTTTGCGGGTGGTCG

GTACTCGAG-3'。

2.2 重组质粒构建

将合成的 CXCR4 启动子 DNA 和荧光素酶报告载体 pGL4.17 进行 Xhol 和 Hind Ⅲ双酶切后,用

T4 DNA连接酶 16 ℃连接过夜,连接产物转化感受态大肠杆菌 DH5α,筛选阳性克隆,双酶切鉴定后获得

重组质粒 pGL4.17-CXCR4P,送至生工生物工程(上海)股份有限公司基因测序鉴定。将质粒扩增后,用去内毒素质粒提取试剂盒提取无内毒素的重组质粒,备用。见图1。

2.3 质粒转染

含 10%胎牛血清 DMEM 培养基 37 ℃、5%CO2

培养 293 细胞。将 293 细胞以 5×105/mL 密度接种于

24孔板,待细胞生长至汇合80%,按 SuperFectin Ⅱ

脂质体转染试剂盒说明书,将重组质粒 pGL4.17CXCR4P(200 ng/孔)和内参质粒 pRL-TK(60 ng/孔)

共转染至 293 细胞。同时,将质粒 pGL4.17 和 pRL-TK共转染作为阴性对照组。2.4 启动子活性评价

质粒转染 24 h后更换细胞培养基,加入 TGF-β1

(2 ng/mL)诱导细胞 24 h,按照双荧光素酶报告基

因检测试剂盒说明书检测各孔荧光强度:PBS清洗细胞 2 次,各孔加入 100 μL 细胞裂解液,室温振摇裂解 20 min彻底裂解细胞。取20 μL细胞裂解液上清,加入 100 μL 荧光素酶检测试剂Ⅱ,酶标仪设置为检测化学发光,检测方式为延迟2 s后读取 10 s内荧光值,再加入海肾荧光素酶检测试剂(Stop and Glo®),猝灭荧光后检测海肾荧光素酶活性。荧光素酶活性=每组萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。将所测数值与阴性对照组荧光素酶活性值相比,转染

pGL4.17-CXCR4P 组荧光素酶活性值为比较后的相对值。

2.5 建立稳定转染 pGL4.17-CXCR4P 单克隆细胞株将 293 细胞种植于6孔板,达到汇合90%时进行细胞转染,24 h 后换液,加入终浓度为1 mg/mL 的G418继续培养,持续处理10 d 后,PBS清洗死亡细胞,胰酶消化贴壁细胞,收集细胞后吹打成单细胞悬液,细胞以1 个/孔密度种植于 96孔板。待细胞克隆形成后,将各个克隆的细胞以相同密度接种于 96 孔板,24 h 后,加入 D-luciferin 至终质量浓度60 μg/mL,荧光活体成像系统拍摄,选择信号最强的单克隆扩大培养,并命名为 293-CXCR4 单克隆细胞。2.6 药物筛选293-CXCR4 单克隆细胞以 1×104/mL 铺于 96 孔板,待细胞汇合度约90%~95%后无血清培养,加入

候选中药单体(8 μg/mL),参考 Lan T H 等[8]报道,将人参皂苷 Rb1作为阳性对照药物,不加入任何药物作为阴性对照组。作用 24 h 后,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性值。将所测得数值与阴性对照组的荧光素酶活性值相比,阳性对照组和候选药物组荧光素酶活性值为比较后的相对值。2.7 异体间充质干细胞分离培养应用差速贴壁法分离骨髓中 MSCs。将 SD 大鼠拉颈处死,用75%乙醇浸泡消毒 8 min,分离双侧股 骨和胫骨。剔除骨组织周围组织后,暴露骨髓腔,用10 mL注射器抽取PBS冲洗骨髓腔,将带有骨髓细胞的PBS收集于10 mL离心管,1000 r/min 离心10 min。

弃上清液,用含 10%胎牛血清、1%青-链霉素的

DMEM 培养液重悬细胞,以 5×105个/mL 密度均匀

接种于 25 cm2培养瓶中,置37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。第 3日更换培养液后继续培养。当细胞汇合 70%~80%时传代。取 3~5 代 MSCs 进行后续实验。2.8 Western blot 检测

将 MSCs 接种于6 孔板,24 h后加入筛选出的中

药单体,处理24 h后收集 MSCs,PBS 清洗 2遍,加RIPA 裂解液,4 ℃裂解 30 min 后,4 ℃、12 000 r/min

离心 15 min,收集上清液,按 Bradford 法测定蛋白含

量。加入 5×loading buffer,于 100 ℃变性5 min。将

样品加入 10%SDS-PAGE 胶样品槽中,150 mV电泳

50 min 后,100 mV 转膜 1 h至硝酸纤维素膜。一抗

4 ℃孵育过夜。TBST反复洗膜后,HRP标记二抗孵

育 1 h,洗膜后化学发光试剂显色,用凝胶成像系统

拍摄图片。

3 统计学方法

采用 Graphpad5.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s — 表示,组间比较采用 LSD-t 检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 构建重组质粒

琼脂糖凝胶电泳成像显示,Xhol 和 HindⅢ双酶切产物在291 bp和5567 bp处有特异性条带(见图2),与理论值相一致。重组质粒经生工生物工程(上海)股份有限公司基因测序鉴定后与 CXCR4 基因序列完全一致。以上结果表明成功构建 pGL4.17-CXCR4P 重组质粒。

5000

4000

3000

2000

1000

750

500

250

100

注:M.DNA Maker;1.双酶切 DNA;2.重组质粒 pGL4.17-CXCR4P DNA

图 2 pGL4.17-CXCR4P 双酶切鉴定4.2 检测 CXCR4 启动子活性

TGF-β1 诱导 24 h后,转染 pGL4.17-CXCR4P 的

荧光素酶活性相对值为 19.7±0.32,见图 3。表明

TGF-β1 能增强 CXCR4启动子活性,提示该细胞模型可用于筛选增强CXCR4表达的中药单体。 阴性对照组 pGL4.17-CXCR4P

图 3 质粒转染 293 细胞后 CXCR4启动子活性检测4.3 建立稳定转染细胞株为了保证双荧光素酶反应灵敏,筛选结果均一,将转染 pGL4.17-CXCR4P 的 293 细胞进行单克隆培养,筛选出稳定转染的细胞株,即 293-CXCR4 单克隆细胞株。活体成像荧光系统筛选结果显示,3 号单

克隆细胞株光通量最强(见图4),将其扩增后液氮冻存备用。 图 4 不同单克隆细胞株荧光值比较4.4 筛选中药单体双荧光素酶报告基因检测系统检测结果显示:与阴性对照组比较,候选单体2、5、6、10 组荧光素酶活性相对值明显升高,候选单体3 组 CXCR4 荧光素酶活性相对值明显降低;候选单体6组荧光素酶活性相对值高于阳性对照组。以上结果说明,候选单体2、5、6、10 能增强 CXCR4启动子活性,其中候选单体6作用最强,见图5。 注:与阴性对照比较,**P<0.01;与阳性对照组比较,##P<0.01图 5 不同候选单体对 CXCR4启动子活性的影响 4.5 促进 CXCR4 表达初步验证为验证本细胞模型的可靠性,本研究采用Western blot 验证筛选出的单体 6 促进 MSCs 表达CXCR4 的作用。结果显示,候选单体 6 能明显增强MSCs 中 CXCR4表达,且具有剂量依赖性,见图6。此结果证明该细胞筛选模型成功筛选出具有促进干细胞 CXCR4表达作用的中药单体。 浓度/(μmol/L)注:与0 μmol/L 比较,**P<0.01;与 5 μmol/L 比较,##P<0.01;

与 10 μmol/L 比较,△△P<0.01

图 6 不同浓度候选单体6促进 MSCs 表达 CXCR4 比较5 讨论CXCR4/SDF-1轴在干细胞归巢中发挥重要作用。CXCR4 表达于多种干细胞膜,能与 SDF-1 特异性结合,介导干细胞向 SDF-1 表达区域迁移和黏附[4]。急

性 MI 后,缺血部位的心肌组织分泌 SDF-1,募集干细胞归巢以修复受损组织。用体外培养的MSCs 移植治疗 MI 是干细胞研究的热点,然而随着传代次数的增多,MSCs 中 CXCR4 的表达水平显著降低[9],削弱其向受损心肌迁移的能力,严重降低了干细胞移植的治疗效果,而通过基因修饰[10]等手段使 MSCs 过表达CXCR4 则能明显促进其向 SDF-1 分布区域的迁移。因此,以 CXCR4 为靶点,筛选出具有上调干细胞CXCR4 表达水平的中药单体,可能具有促进移植后干细胞归巢的作用。

本研究将 CXCR4 启动子基因片段和带有荧光素酶基因的报告载体重组得到重组质粒,转染293 细胞后,通过检测荧光素酶的表达反映 CXCR4 启动子的活性强弱。在此基础上,通过单克隆培养,建立稳定表达 CXCR4 启动子的单克隆细胞株,利用荧光素酶报告基因检测系统筛选中药单体。最后采用 Western blot 技术,初步证明筛选出的中药单体对体外培养MSCs 的 CXCR4 表达有显著促进作用,验证了该细胞筛选模型的可靠性。与传统的筛选方法相比,应用细胞模型筛选中药单体,更接近体内真实的生理环

境,结果可靠性较高;同时,利用单克隆细胞株筛选具有结果均一性好、可重复性高等优点;此外,利用双荧光素酶报告基因,检测 CXCR4 启动子的活性,操作简单,灵敏度高,实验周期短,非常适用于中药单体的高通量筛选。

CXCR4 不仅介导干细胞归巢,在恶性肿瘤转移和艾滋病病毒感染 T 细胞的过程中均发挥重要作用[11]。因此,本研究建立的细胞筛选平台不仅可用于干细胞治疗 MI 中药单体的筛选,也可用于抗肿瘤和抗艾滋病中药单体的筛选,为传统中药的现代研究提供方法学参考。参考文献:

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(收稿日期:2018-05-01)

(修回日期:2018-05-24;编辑:华强) 开放科学(资源服务)标识码(OSID)内含全文PDF和增强文件

图 1 构建质粒 pGL4.17-CXCR4P 示意图

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