一测多评法用于忍冬藤多成分含量测定的适用性研究

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

田伟 1,2,3,甄亚钦 1,2,3,王鑫国 1,2,3,田宇柔 1,2,3,李军山 4,牛丽颖 1,2,3

1.河北中医学院,河北 石家庄 050091;2.河北省中药配方颗粒工程技术研究中心,河北 石家庄 050091;

3.河北省高校中药配方颗粒应用技术研发中心,河北 石家庄 050091;

4.神威药业集团有限公司,河北 石家庄 051430

摘要:目的 建立一测多评法同时测定忍冬藤中绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、

马钱苷6种成分含量的方法,并验证该法在忍冬藤质量控制中应用的可行性与适用性。方法 以绿原酸为内参

物,采用 Waters Symmetry C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.4%磷酸,梯度洗脱,流速

为 1 mL/min,绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C检测波长为 327 nm,马钱苷检测波长为

236 nm,柱温 35 ℃。结果 建立了忍冬藤中绿原酸与咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷的相对校正因子;一测多评法的计算值与外标法实测值无明显差异。结论 一测多评的质量控制模式可用于忍冬藤中6种不同成分的多指标同步质量评价。关键词:一测多评;相对校正因子;绿原酸;忍冬藤;质量评价DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.017中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)11-0077-06

Applicability Study on QAMS for Multi-component Content Determination of Lonicerae Japonicae Caulis

TIAN Wei1,2,3, ZHEN Ya-qin1,2,3, WANG Xin-guo1,2,3, TIAN Yu-rou1,2,3, LI Jun-shan4, NIU Li-ying1,2,3

1. Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050091, China;

2. Hebei TCM Formula Granule Engineering&Technology Research Center, Shijiazhuang 050091, China;

3. TCM Formula Granule Research Center of Hebei Provincial Universities, Shijiazhuang 050091, China;

4. Shineway Pharmaceutical Co, Ltd, Shijiazhuang 051430, China

Abstract: Objective To establish a QAMS method for content determination of six compositions (chlorogenic acid, caffeic acid, cryptochlorogenin acid, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C and loganin) from Lonicerae Japonicae Caulis; To verify the feasibility and applicability of this method in quality control of Lonicerae Japonicae Caulis. Methods Chlorogenic acid was set as internal reference substance. The HPLC analysis was performed on a Waters Symmetry C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) with a mobile phase consisted of acetonitrile and 0.4% phosphoric acid solution in gradient elution manner at a flow rate of 1 mL/min. The column temperature was maintained at 35 ℃ , and the detection wavelength was set at 327 nm for chlorogenic acid, caffeic acid, cryptochlorogenin acid, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C and 236 nm for loganin. Results The relative correction factors of caffeic acid, cryptochlorogenin acid, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C and loganin were established; there was no obvious difference between calculated value of QAMS and measured value of external standard method. Conclusion The quality control mode of QAMS can be used for multi-index synchronization quality evaluation of the six compositions from Lonicerae Japonicae Caulis.

Keywords: QAMS; relative correction factors; chlorogenic acid; Lonicerae Japonicae Caulis; quality evaluation 忍冬藤为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.

基金项目:河北省高等学校科学技术研究项目(ZD2015001);

河北省中医药管理局科研计划项目(2017015)

通讯作者:牛丽颖,E-mail:[email protected] 的干燥茎枝,具有清热解毒、疏风通络功效,用于温病发热、热毒血痢、痈肿疮疡、风湿热痹、关节红肿

热痛[1]。忍冬是我国传统药用植物,具有抗菌、抗炎、

调节免疫、抗氧化等多种药理作用[2]。《本草纲目》云: “忍冬,茎叶同花,功用皆同。”金银花是忍冬的干

燥花蕾或带初开的花,在中药制剂、茶饮、保健品等领域应用广泛,因需求量大,出现供不应求的现状。忍冬藤资源丰富、价格便宜,具有良好的开发前景。忍冬藤含有有机酸、环烯醚萜苷、黄酮等多类成

分[3-4],2015 年版《中华人民共和国药典》仅将马钱苷和绿原酸作为忍冬藤的含量测定指标成分,不能完全反映该药材的真实品质。一测多评法(quantitative analysis of multi-components by single marker,QAMS)是利用中药中有效成分函数关系和比例关系,通过测定 1个有效成分(性质稳定且易得到的对照品)实现多个成分(性质不稳定且难得到的对照品)的同时测定,该方法快速、简便,是一种符合中药多成分特点的多指标质量评价模式,已广泛应用于中药的质量控制中[5]。为了对忍冬藤进行多指标控制,本研究以绿原酸为内参物,对咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷 QAMS同步测定的可行性与适用性进行探讨与评价。1 仪器与试药

岛津高效液相色谱仪,包括 LC-15C 泵、SPD-15C

型紫外检测器、SIL-10AF 自动进样器、CTO-15C 柱温箱、岛津LC色谱工作站;美国赛默飞公司 Ultimate 3000高效液相色谱仪,包括低压三元梯度泵、自动进样器、DAD检测器、变色龙色谱工作站;沃特世 e2695高效液相色谱仪,包括低压四元梯度泵、自动进样器、

2489 紫外检测器、Empower 3色谱工作站;色谱柱为

Waters Symmetry C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Wondasil C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent

C18 柱( 4.6 mm × 250 mm , 5 μm );电子天平

(TB-215D,德国赛多利斯);KQ-250E 超声波清洗器(昆山市超声仪有限公司)。

绿原酸对照品(批号 PY20170216,纯度 99.96%)、隐绿原酸对照品(批号 PY20170224,纯度 99.79%)、

异绿原酸C对照品(批号PY20170303,纯度 91.88%)、马钱苷对照品(批号 PY20170108,纯度 99.31%),南京普怡生物科技有限公司;咖啡酸对照品(批号

110885-200102,纯度 100.00%)、异绿原酸 A对照品

(批号 111782-201405,纯度 92.00%),中国食品药品检定研究院,乙腈为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。20 批忍冬藤样品中 15批由神威药业集团有限公司提供,另5批分别购自石家庄乐仁堂、新兴药房、德济堂、栀子药房、百医堂,经河北省药品检验研究院孙宝惠主任中药师鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝,编号为 1~20。

2 方法与结果2.1 分析方法的建立和验证2.1.1 色谱条件

色谱柱为 Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm,

5 μm);流动相为乙腈(A)-0.4%磷酸(B),梯度洗

脱(0~30 min,7%A;30~32 min,7%~10%A;32~

44 min,10%A;44~50 min,10%~21%A;50~60 min,

21%~34%A;60~65 min,34%A);流速 1 mL/min;

柱温 35 ℃;检测波长:绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C为327 nm,马钱苷为236 nm;

进样量 10 —L。色谱图见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备分别精密称取绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷对照品适量,加50%甲

醇制成浓度分别为 0.097 9、0.020 6、0.007 5、0.054 4、

0.021 3、0.169 8 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备取忍冬藤粉末(过3 号筛)约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇 25 mL,称定质量,超声处理(功率250 W,频率 40 kHz)30 min,放冷,再称定质量,用50%甲醇补足减失的质量,摇匀,过滤,取续滤液,即得。2.1.4 方法学考察2.1.4.1 线性关系考察

分别精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液 2、4、6、10、15、20 —L注入液相色谱仪,测定绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷峰面积,以峰面积为纵坐标,对照品进样量(μg)为横坐标,绘制标准曲线,结果见表 1。绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸 A、异绿原酸 C、马钱苷 6种成分在相应范围内呈良好线性关系。

2.1.4.2 精密度试验

精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液 10 —L,

连续进样6次,计算绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异

绿原酸 A、异绿原酸 C、马钱苷的峰面积 RSD 分别

为 0.23%、0.28%、0.42%、0.23%、0.10%、0.18%,

表明仪器精密度良好。

2.1.4.3 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液,分别于配制后0、2、

4、6、10、16 h 进样 10 —L,测得绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷的峰面

积 RSD 分别为 1.85%、1.68%、1.57%、1.91%、1.66%、1.08%,表明供试品溶液在 16 h内稳定。2.1.4.4 重复性试验取同一批号忍冬藤样品6份,每份约1 g,精密

称定,按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,分别测定绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原

酸 C、马钱苷的峰面积,计算含量的 RSD 分别为1.56%、1.08%、1.27%、1.46%、1.17%、0.83%,表明本方法重复性良好。2.1.4.5 加样回收率试验

取已知含量的样品粉末9份,每份约 0.5 g,精密

称定,置 25 mL容量瓶中,分别按各成分含量的80%、

100%、120%精密加入绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷的对照品贮备液,

按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件进样测定,计算加样回收率及RSD,结果

见表2~表7。表明本方法的准确度良好。

2.2 相对校正因子的确定

2.2.1 相对校正因子的计算

取“2.1.2”项下混合对照品溶液,分别进样 2、6、

10、16、20 µL,计算各相对校正因子。fk/m=fk/fm= W ×Am/(Wm×Ak),式中,Ak 为内标物峰面积, k Wk为内标物质量,Am为组分 m 的峰面积,Wm为组

分m的质量。以绿原酸为内标物,分别计算咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C和马钱苷的相对校正因子,结果见表8。 2.2.2 相对校正因子重现性考察按相对校正因子测定条件和方法,分别采用3种不同的色谱仪和3种色谱柱测定,并计算绿原酸对咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C和马钱苷的 fk/m,计算平均值,结果见表 9。2.2.3 待测色谱峰定位采用不同色谱仪及色谱柱,待测组分的保留时间会有所波动,在色谱峰定位中一般采用相对保留时间或保留时间差法[6-8]。取“2.1.2”项下混合对照品溶液,分别采用3种不同色谱仪和3种色谱柱测定,并计算绿原酸对咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C 和马钱苷的相对保留时间(rk/m),结果见表 10,

RSD 均小于5%,表明利用相对保留时间进行色谱峰

的定位是可行的。

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