循经选穴针刺对失眠大鼠下丘脑腹外侧视前区褪黑素含量及其受体基因表达的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

谢莉娜,谢志强,郭鑫,魏歆然,岳增辉

湖南中医药大学,湖南 长沙 410208

摘要:目的 观察循经选穴针刺对失眠大鼠下丘脑腹外侧视前区褪黑素(MT)含量及其受体MT1、MT2基因表达的影响,探讨针刺治疗失眠症的作用机制及循经选穴针刺对腧穴配伍的效应。方法 将 60 只 SD 大鼠随机分为空白组、模型组、百会+神门组、百会+三阴交组、百会+非经非穴组,每组12只。大鼠腹腔注射DL-4-氯苯基丙氨酸混悬液建立失眠模型,各治疗组针刺相应腧穴,每次30 min,治疗 7d。采用 ELISA 检测大鼠下丘脑腹外侧视前区MT含量;采用实时荧光定量PCR检测大鼠下丘脑腹外侧视前区MT1、MT2 mRNA表达。结果 与空白组比较,模型组MT含量及 MT1、MT2 mRNA 表达明显降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,各针刺组MT含量及MT1、MT2 mRNA表达明显升高(P<0.05,P<0.01),且以百会+神门组升高最为明显。结论 针刺通过调节失眠大鼠下丘脑腹外侧视前区MT含量及其受体MT1、MT2 mRNA 的表达发挥治疗作用,且循经选穴针刺可能是腧穴配伍效应的影响因素之一。关键词:针刺;失眠;褪黑素;褪黑素受体1a;褪黑素受体1b;循经选穴;大鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.011

中图分类号:R245 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)12-0040-05

Effects of Acupuncture Treatment Based on Meridians and Acupoint Selection on MT Content and MT Receptor Expressions in VLPO in Insomnia Rats

XIE Li-na, XIE Zhi-qiang, GUO Xin, WEI Xin-ran, YUE Zeng-hui

Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

Abstract: Objective To observe the effects of acupuncture treatment based on meridians and acupoint selection on the melatonin (MT) content and the expression of MT1 and MT2 genes in the ventrolateral preoptic area (VLPO) of insomnia rats; To investigate the therapeutic mechanism of acupuncture in treating insomnia and the effect of acupuncture treatment based on meridians and acupoint selection on compatibility effect of acupoints. Methods Totally sixty SD rats were randomly divided into blank group, model group, Baihui + Shenmen group, Baihui + Sanyinjiao group and Baihui + non-acupoint group, with 12 rats in each group. Chlorophenylalanine suspension was intraperitoneal injected to establish insomnia model rats. Each treatment group received acupuncture in relevant acupoints, 30 min each time, for 7 d. Levels of MT in the VLPO were detected by ELISA, and real-time fluorescence quantitative PCR was used to measure the expressions of MT1 and MT2 mRNA in VLPO of rats. Results Compared with blank group, levels of MT and expressions of MT1 and MT2 mRNA in model group decreased significantly (P<0.05, P<0.01); Compared with model group, levels of MT and expressions of MT1 and MT2 mRNA in acupuncture groups increased significantly (P<0.05, P<0.01), and Baihui + Shenmen group increased the most obvious. Conclusion Acupuncture treatment can play a therapeutic role by regulating levels of MT and the expressions of MT1 and MT2 mRNA in the VLPO of insomnia rats, and acupuncture treatment based on meridians and acupoint selection may be one of the factors that cause the difference of compatibility effect of acupoints.

Keywords: acupuncture; insomnia; melatonin; MT1; MT2; meridians and acupoint selection; rats

失眠是一种最常见的睡眠障碍,主要特点为持续长时间不能获得正常睡眠或对睡眠质量不满意。其病因和发病机制复杂,患病率在快节奏生活方式的现代社会中有逐年增高趋势,世界范围内失眠障碍临床患病率约为 10%~12%[1]。研究表明,睡眠是大脑中调节睡眠-觉醒周期的多个中心共同参与的神经化学过程,而下丘脑腹外侧视前区(ventrolateral preoptic

[2-3] area , VLPO )为其中一主要结构 。褪黑素(melatonin,MT)于 1959年被国外学者首次发现,在人体广泛分布,主要存在于视交叉上核,为松果体分泌的吲哚类激素,研究发现其有镇静催眠和调节睡

眠觉醒周期的作用[4]。研究表明,褪黑素调节睡眠是通过与褪黑素受体1a(MT1)、褪黑素受体 1b(MT2)作用来实现,而这两受体作用方式不同,前者主要抑

制神经元活动,后者主要诱导相位转变[5]。

近年来,针刺治疗失眠疗效显著[6],且越来越被患者接受。临床上针刺治疗失眠选穴方法多样,正确的腧穴配伍是提高针刺疗效的关键因素之一,不同的

腧穴配伍方式与针刺治疗失眠的疗效密切相关[7-8]。而循经选穴作为腧穴配伍的重要原则之一,主要是指根据经脉循行所过部位的病变、经脉所属脏腑的病变

选择相应经脉上的腧穴进行治疗的方法[9]。本研究通过固定按部选穴(百会),对比配伍本经穴、他经穴、非经非穴对失眠大鼠 VLPO 区 MT1、MT2 表达的影响,探讨针刺治疗失眠的疗效机制及循经选穴针刺对腧穴配伍效应的影响,为临床针灸治疗失眠的选穴原则及配穴方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

SD雄性大鼠 60 只,SPF 级,8~9周龄,体质量

220~250 g,湖南中医药大学实验动物中心,动物合格证号 SCXK(湘)2013-0004。实验开始前,大鼠适应性饲养1周,每笼5只,饲养于湖南中医药大学实验动物中心实验室,温度23~26 ℃,相对湿度45%~

65%,所有动物在同等条件下按组分笼喂养,自由摄食饮水,适应性喂养1周。将大鼠随机分为空白组、模型组、百会+神门组、百会+三阴交组、百会+非经非穴组,每组12 只。

1.2 主要试剂及仪器

DL-4-氯苯基丙氨酸(PCPA),美国 Sigma 公司;戊巴比妥钠,Merck公司;碳酸氢钠片、氢氧化钠片,成都市科龙化工试剂厂;阿拉伯胶,天津市光复精细化工研究所;动物型超纯水机,摩尔公司;pH 精密

试纸(5.5~9.0),垫中垫公司;电热水恒温杯,Promega 公司;RNA提取试剂 Trizol Reagent,Invitrogen 公司;反转录(M-MLV)、核糖核酸酶抑制剂(RNasin)、dNTP、Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)、随机引物(Random primers)、琼脂糖(agarose),美国Promega 公司;荧光定量试剂盒(SYBR Green qPCR), Promega 公司;实时荧光定量PCR 扩增仪,ABI 7500 FAST,美国 ABI 公司;ABI 7300 Real-Time PCR System,美国 ABI公司;超低温冰箱,德国贺利氏公司;UVP凝胶扫描系统,美国UVP 公司;微量移液器,德国 Gilson 公司;DYZ-22A型双恒定时电泳仪、DYY-Ⅱ桥式电泳仪,北京六一仪器厂;台式高速冷

冻离心机,湘仪离心机仪器有限公司;0.25 mm×25 mm华佗牌一次性使用无菌针灸针,苏州医疗用品厂有限公司。

1.3 造模

采用经典 PCPA 方法建立失眠大鼠模型[10]。实验前大鼠称重;除空白组外,其余组第8日开始腹腔注射 PCPA 混悬液(500 mg/kg,50 mg/mL),1 次/d,连续 2 d,制作失眠大鼠模型。具体操作:PCPA临用前按大鼠体质量用事先配制的弱碱性生理盐水(pH值7~8)配制成混悬液。预实验测得PCPA 按大鼠体质量35 mg/kg剂量腹腔注射为引起100%大鼠睡眠的最小阈剂量。用注射器取与大鼠体质量相应剂量的混悬液腹腔注射。同时,空白组取等体积弱碱性生理盐水腹腔注射。首次注射PCPA 混悬液 36 h后,观察模型组大鼠生理状态,失眠大鼠出现昼夜节律缺失、日间与夜晚皆活动不断、对外界刺激异常敏感、烦躁不安等相关症状,结合经典的戊巴比妥钠翻正实验,观察空白组与模型组大鼠睡眠潜伏期及睡眠总时间的差异,进行失眠模型评价,若模型组与空白组比较差

异有统计学意义(P<0.05),则提示造模成功[11]。

1.4 干预

造模后,于第2次注射 PCPA 混悬液 24 h 后,开始对实验大鼠进行干预。各针刺组大鼠选穴参考大鼠

穴位定位[12]。空白组:大鼠常规饲养,不做任何处理;模型组:大鼠予以仰卧位束缚于鼠板上,只捆绑,不进行针刺,每日 1 次,30 min/次,连续7d,每日捆绑结束后正常进食;百会+神门组选取“百会”(位于顶骨正中处)、双侧“神门”(位于前肢内侧腕部横纹尺骨边缘);百会+三阴交组选取“百会”、双侧“三阴交”(位于后肢内踝尖直上10 mm);百会+非经非穴组选取“百会”、非经非穴点(位于肘内侧,肘尖与腋窝连线中点,在非经脉循行路线上及非穴位所在部位,此点参

照成都中医药大学所制定的选穴方法)。具体操作如下:将大鼠仰卧位束缚于鼠板上,定穴后剪毛、消毒,

0.25 mm×25 mm华佗牌针灸针进行针刺,“百会”从后向前平刺20 mm,“神门”直刺1 mm,“三阴交”和非经非穴点均直刺5 mm,留针 30 min,每 10 min行针 1次,行针时间1 min,不提插、只捻转,行平

补平泻手法,幅度和频率为均等手法,30 min 时,在行针结束后出针,每日1次,每日治疗后正常进食,连续 7 d。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 行为学观察观察大鼠精神状态、动作与反应灵敏性、昼夜节律、体质量及活动度、饮食、饮水等与失眠相关的指标变化。

1.5.2 ELISA 检测褪黑素含量所有大鼠于末次治疗后,禁食不禁水12 h,断头处死后立即剪开颅骨顶骨、硬脑膜,冰台上取出VLPO

区组织,置于-80 ℃冰箱保存。测定时以空白管调零,

450 nm 波长依序测量各孔吸光度(OD 值)。测定应在加终止液后10 min内进行。严格按试剂盒说明书操作。根据标准品浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程,再将样品的OD值代入回归方程计算出样品浓度。

1.5.3 实时荧光定量PCR检测褪黑素受体1、2 基因表达

实时荧光定量PCR检测严格按说明书进行操作。冰浴条件下超声粉碎VLPO区组织,离心,先后加入

氯仿、异丙醇、75%乙醇,RPE Solution,离心,再加入75%乙醇,离心,加入 30 μL DEPC-treated ddH2O,放置 5 min,离心,即得 RNA溶液;电泳槽中电泳后,定性检验提取 RNA 质量,行反转录反应,最终放入荧光定量PCR仪进行定量反应,计算PCR 产物 2-ΔΔCt值,即相对定量法测定初始模板量。引物序列见表1。 1.6统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s 表示,经检验满足正态性及方差齐性,采用方差— 分析,用 LSD法进行多重比较;不满足方差齐性,用

Tamhane'T2 检验。P<0.05表示差异有统计学意义。2 结果

2.1 睡眠实验结果空白组造模前后睡眠潜伏期及睡眠总时间比较

差异无统计学意义(P>0.05);造模组大鼠注射戊巴比妥钠后,与造模前比较,造模后睡眠潜伏期显著延

长,差异有统计学意义(P<0.05),睡眠总时间显著

缩短,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。—

2.2 大鼠死亡情况

实验中共有7只大鼠死亡,其中模型组4只,百会+三阴交组1只,百会+非经非穴组2 只。

2.3 大鼠行为学观察结果空白组大鼠昼夜节律及饮食、饮水量正常,行为活动正常,大小便变化不明显,毛发光泽;与空白组比较,造模组大鼠注射PCPA混悬液后出现昼夜活动不停,饮食量显著减少,饮水量显著增多,昼夜节律消失,互相攻击,对外界各种刺激敏感度提高,毛发光泽度差,笼内垫料较潮湿,粪便颜色变浅、质地较软;与模型组比较,各针刺组于治疗第3日开始恢复昼夜节律,饮食量较前递增,饮水量较前递减,粪便颜色恢复正常黄褐色,质地较前变硬。

2.4 针刺对失眠大鼠下丘脑腹外侧视前区褪黑素含量的影响

与空白组比较,模型组大鼠VLPO 区 MT含量明

显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,各针刺组大鼠VLPO 区 MT含量明显增加,差异

有统计学意义(P<0.05);与非经非穴组比较,百会+神门组大鼠VLPO 区 MT含量明显增加,差异有统计

学意义(P<0.05)。结果见表 3。

2.5 针刺对失眠大鼠下丘脑腹外侧视前区褪黑素受体 1、2 mRNA表达的影响

与空白组比较,模型组大鼠VLPO 区 MT1、MT2 mRNA 表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,各针刺组大鼠 VLPO 区 MT1、MT2 mRNA 表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与百会+神门组比较,百会+三阴交组、百会+非经非穴组大鼠VLPO 区 MT1、MT2 mRNA表达显著降

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