HPLC测定胃康宁颗粒中5种指标成分含量

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 - 基金项目:北京市科技计划“十病十药”研发(Z161100001816016) 通讯作者:尹兴斌,E-mail:[email protected]

郭琳,倪健,杜梓萱,张海英,尹兴斌北京中医药大学中药学院,北京 100102

摘要:目的 建立胃康宁颗粒中指标成分表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和黄芩苷的含量测定方法,为胃康宁颗粒的质量控制提供依据。方法 采用 HPLC,色谱柱 Agilent Eclipse Plus C18 为(4.6 mm×

250 mm,5 µm)。黄连生物碱流动相为乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液(50∶50,每 100 mL中加十二烷基硫酸钠 0.4 g,再以磷酸调节pH 值为 4.0),检测波长为 345 nm;黄芩苷流动相为乙腈-0.2%磷酸(21∶79),检测波长为 280 nm。结果 黄连生物碱及黄芩苷测定均无阴性干扰,表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱及黄芩苷的进样量分别在0.005 26~0.211 µg(r=0.999 6)、0.005 37~0.215 µg(r=1)、0.005 55~0.222 µg

(r=1)、0.028 06~1.123 µg(r=1)、0.096 5~1.930 µg(r=0.999 8)范围内线性关系良好,精密度、稳定性均良好,平均回收率分别为 97.63%(RSD=2.32%)、99.05%(RSD=2.21%)、97.66%(RSD=1.94%)、101.50%

(RSD=1.92%)、100.31%(RSD=1.12%)。结论 本方法准确、稳定、重复性好,可用于胃康宁颗粒中表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和黄芩苷的含量测定。关键词:胃康宁颗粒;表小檗碱;黄连碱;盐酸巴马汀;盐酸小檗碱;黄芩苷;含量测定

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.020

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)12-0083-05

Content Determination of Five Marker Components in Weikangning Granules by HPLC

GUO Lin, NI Jian, DU Zi-xuan, ZHANG Hai-ying, YIN Xing-bin

College of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China Abstract: Objective To establish an HPLC method for content determination of epiberberine, coptisine, palmatine, berberine and baicalin; To provide the basis for the quality control standard of Weikangning Granules. Methods Agilent Eclipse Plus C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) was used. For rhizoma coptidis alkaloids, mobile phase was acetonitrile - 0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution (50:50, 0.4 g sodium dodecyl sulfate was added in each 100 mL, to adjust the pH 4.0 with phosphoric acid), and detection wavelength was 345 nm; For baicalin, mobile phase was acetonitrile - 0.2% phosphoric acid solution (21:79), and detection wavelength was

280 nm. Results No negative interference was found in determination of rhizoma coptidis alkaloids and baicalin. Epiberberine, coptisine, palmatine, berberine and baicalin showed good liner relationship in the range of 0.005 26–

0.211 µg (r=0.999 6), 0.005 37–0.215 µg (r=1), 0.005 55–0.222 µg (r=1), 0.028 06–1.123 µg (r=1), 0.096 5–1.930 µg

(r=0.999 8); degree of precision of instrument and the stability of samples were good. The average recovery rates were 97.63% (RSD=2.32%), 99.05% (RSD=2.21%), 97.66% (RSD=1.94%), 101.50% (RSD=1.92%) and 100.31%

(RSD=1.12%), respectively. Conclusion The method is accurate, stable and reproducible. It can be used for the content determination of epiberberine, coptisine, palmatine, berberine and baicalin of Weikangning Granules.

Keywords: Weikangning Granules; epiberberine; coptisine; palmatine; berberine; baicalin; content determination

胃康宁方是中国中医科学院望京医院的临床经验方,由黄连、黄芩等组成,具有消痞散结、益气养阴、活血解毒等功效,用于治疗寒热互结、气阴不足、毒瘀互阻所致的慢性萎缩性胃炎。经长期临床验证, 疗效确切,且无毒副作用。该方长期以汤剂形式应用于临床,患者服用、贮存、携带很不方便。为方便患者使用而制成颗粒。黄连为方中君药,主要含有生物碱类成分,包括表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀及盐酸小檗碱等,现代药理研究表明,黄连生物碱具有明显的抗炎作用以及胃黏膜的保护作用,其中小檗碱对于免疫系统具有较强的调节作用[1-3]。黄芩为方中臣

药,主要含有黄酮类成分,包括黄芩苷、黄芩素等。现代药理研究表明,黄芩苷抗炎作用较强,可显著影响白细胞的多种功能,如抑制白细胞内白三烯 B4、白三烯 C4的生物合成,抑制趋化肽(fMLP)激发的白细胞内 Ca2+升高,并促进内环磷腺苷水平提高[4]。为了更好地控制胃康宁颗粒质量,本研究建立测定该制剂指标成分表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和黄芩苷含量的方法。1 仪器与试药

LC-20AT 高效液相色谱仪(日本岛津,SPD-M20A PDA 检测器),BT125D 分析天平(北京赛多利斯仪

器系统有限公司),KQ3200DE 型数控超声波清洗器

(昆山市超声仪器有限公司),HH-4 型恒温水浴锅(国华电器有限公司)。

黄连碱(批号 112026-201601,纯度 95.1%)、盐酸巴马汀(批号 110732-201611,纯度 86.8%)、盐酸小檗碱(批号 110713-201212,纯度 86.7%)及黄芩苷(批号 110715-201619,纯度 93.5%),中国食品药品检定研究院;表小檗碱对照品(纯度98.0%,批号

W06M8Z30708),上海源叶生物科技有限公司;水为纯净水,娃哈哈集团有限公司;乙腈为色谱纯,美国Fisher 公司;甲醇、磷酸为分析纯,北京化工厂。胃康宁颗粒(批号 20171001、20180101,中日友好医院制剂室制备;批号 20171201,北京中医药大学中试车间制备),黄连阴性颗粒(批号 20171101,自制),黄芩阴性颗粒(批号 20171102,自制)。

2 方法与结果2.1 黄连生物碱含量测定

2.1.1 色谱条件

采用 Agilent Eclipse Plus C18 色谱柱(4.6 mm×

250 mm,5 µm),流动相为乙腈-0.05mol/L 磷酸二氢

钾溶液(50∶50,每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g,再以磷酸调节pH 值为 4.0),流速 0.8 mL/min,检测波长 345 nm,柱温 30 ℃,进样量10 µL。

2.1.2 供试品溶液的制备

取本品 0.2 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,称定质量,超声处理(功率 100 W,频率 40 kHz)30 min,放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,过滤,取续滤液,即得。

2.1.3 对照品溶液的制备取表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL分别含表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱 0.021 05、

0.021 49、0.022 19、0.112 3 mg的混合对照品溶液, 摇匀,备用。

2.1.4 阴性对照溶液的制备

取等量黄连阴性颗粒,按“2.1.2”项下方法制成黄连阴性对照溶液。

2.1.5 专属性试验精密吸取阴性对照溶液、对照品溶液及供试品溶液各 10 µL,分别测定,结果阴性对照在相同保留时间处未见干扰,说明该方法专属性强。色谱图见图1。

2.1.6线性关系考察精密量取混合对照品溶液 0.25、0.5、1.0、2.0、

5.0 mL分别置于 10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,得系列对照品溶液。取系列对照品溶液及混合对照品

溶液,按“2.1.1”项下色谱条件进样检测。以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标,进行线性回归,结果见表1。黄连生物碱在各自浓度范围内呈良好线性关系。

2.1.7精密度试验精密吸取各黄连生物碱对照品溶液10 µL,注入

高效液相色谱仪,按“2.1.1”项下色谱条件连续进样

6 次,测定峰面积,结果表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱RSD 分别为 0.46%、0.22%、0.45%、

0.28%,表明仪器精密度良好。

2.1.8 重复性试验取同一批样品(批号 20171001)约 0.2 g,精密称定,共6 份,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,

按“2.1.1”项下色谱条件测定表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量,结果4种黄连生物碱含量 RSD 分别为 0.85%、0.72%、0.63%、0.67%,表明本方法重复性良好。

2.1.9 稳定性试验取制备好的供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、

10、12、24 h进样测定,结果表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量 RSD 分别为 0.72%、

0.59%、0.60%、0.52%,表明供试品溶液至少在 24 h内稳定。

2.1.10 加样回收率试验取同一批已知黄连生物碱含量的胃康宁颗粒样品(批号 20171001)0.1 g,精密称定,共6份,分别

精密加入混合对照品溶液,按“2.1.2”项下方法制备

供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件进样检测,计算回收率,结果见表2~表 5。

2.2 黄芩苷含量测定

2.2.1 色谱条件

采用 Agilent Eclipse Plus C18 色谱柱(4.6 mm×

250 mm,5 µm),流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶

79),流速 1.0 mL/min,检测波长 280 nm,柱温 30 ℃,进样量 10 µL。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品 0.1 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,称定质量,加热回流60 min,放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,过滤,取续滤液,即得。

2.2.3 对照品溶液的制备取黄芩苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每

1 mL含黄芩苷 0.193 0 mg的对照品溶液,摇匀,作为对照品贮备液,备用。

2.2.4 阴性对照溶液的制备

取等量黄芩阴性颗粒,按“2.2.2”项下方法制成黄芩阴性对照溶液。

2.2.5 专属性试验精密吸取阴性对照溶液、对照品溶液及供试品溶液各 10 µL,分别测定,结果阴性对照在相同保留时间处未见干扰,说明该方法专属性强。色谱图见图2。

2.2.6 线性关系考察精密量取对照品溶液 0.5、1.0、2.5、5.0 mL 分别置于 10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得系列

对照品溶液。取系列对照品溶液及对照品贮备液,按“2.2.1”项下色谱条件进样检测。以黄芩苷峰面积为纵坐标,进样量为横坐标,进行线性回归,得回归方程 Y=3 167 412X-200 460(r=0.999 8),表明黄芩苷进样量在 0.096 5~1.930 µg范围内线性关系良好。

2.2.7精密度试验精密吸取黄芩苷对照品溶液10 µL,按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次,测定峰面积,计算RSD,结果RSD=0.51%,表明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验取同一批样品(批号 20180101),按“2.2.2”项

下方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进样,测定黄芩苷含量,计算RSD,结果 RSD=1.97%,表明本方法重复性良好。

2.2.9 稳定性试验取制备好的供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、

10、12、24 h测定,结果黄芩苷含量的 RSD=0.30%,表明供试品溶液至少在24 h内稳定性良好。

2.2.10 加样回收率试验取同一批已知黄芩苷含量的胃康宁颗粒样品,精密称定 6 份,分别精密加入黄芩苷对照品溶液,按

“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项下 色谱条件下进样检测,计算回收率,结果见表6。 3 讨论本研究建立了胃康宁颗粒中表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和黄芩苷的含量测定方法,专属性、精密度、重复性、稳定性、准确性均符合2015年版《中华人民共和国药典》(四部)通则9101 药品质量标准分析方法验证指导原则的规定,能够准确测定 5种指标成分的含量,为胃康宁颗粒的质量控制提供含量测定方法。

目前,黄连在复方中的应用非常多,由于表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀较盐酸小檗碱含量低,因此大多数研究仅控制盐酸小檗碱含量,忽略了前3种生物碱,而这3种生物碱的药效作用不容忽视,同时测定 4种生物碱的含量能更全面控制复方的质量,保证疗效的稳定性。采用HPLC测定生物碱,拖尾因子容易偏大,造成峰形不对称,影响含量测定的准确性。本研究的测定方法分离度好,峰形对称,能够准确定量。黄芩常与黄连配伍使用,由于测定生物碱的色谱条件特殊,需调节流动相的 pH 值并添加一些表面活性剂来保证峰形对称,而采用普通C18色谱柱虽能在一些色谱条件下同时测定此5种成分,但难以保证其定量的准确性。本研究建立的测定方法可准确测定这5种药效成分。

在黄连生物碱含量测定中,供试品溶液的制备考

察了水、甲醇、甲醇-盐酸(100∶1)等提取溶剂,分别考察了超声及加热回流 30、60、90 min 的提取效果,结果表明,采用甲醇为溶剂,超声处理30 min,黄连生物碱的提取效果最佳。

由于黄连生物碱峰形拖尾严重,所以考察了4种色谱柱(Agilent Zorbax SB-C18、Agilent Eclipse Plus

C18、Merck Rp-C18、Waters Sunfire C18)对黄连生

物碱的分离效果,流动相考察了乙腈-0.2%磷酸等度

不同比例、乙腈-0.2%磷酸梯度、乙腈-0.05 mol/L 磷

酸二氢钾溶液(20∶80)及乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢

钾溶液(50∶50,每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g,再以磷酸调节pH 值为 4.0)等[5-6],流速考察了 0.8、

1.0、1.2 mL/min,结果表明,采用 Agilent Eclipse Plus

C18 色谱柱、以乙腈-0.05mol/L 磷酸二氢钾溶液(50∶

50,每 100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g,再以磷酸调节 pH 值为4.0)为流动相、流速为 0.8 mL/min 时,黄连生物碱无杂质干扰,分离度良好,峰形对称。

在黄芩苷含量测定中,供试品溶液的制备考察了水、甲醇等提取溶剂,以及不同的溶剂倍量和超声、加热回流 30、60、90 min的提取效果,结果表明,采用甲醇为溶剂,加热回流提取60 min,黄芩苷的提取效果最佳。

色谱条件考察了甲醇水、乙腈水、甲醇-0.2%磷

酸(42∶58、40∶60)和乙腈-0.2%磷酸(21∶79、

[7-8]

25∶75、30∶70) 等流动相及 0.8、1.0、1.2 mL/min

不同流速,结果表明采用乙腈-0.2%磷酸(21∶79)为流动相、流速为 1.0 mL/min 时,黄芩苷的保留时间 适中,阴性对照无干扰,分离度良好,峰形对称。

本试验测得胃康宁颗粒样品中表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和黄芩苷的平均含量分别为 1.01、1.33、1.88、6.89、12.55 mg/g。考虑到大生产时中药材受采收季节、产地、贮存环境及时间的影响,因此将胃康宁颗粒中5种成分最低含量限度暂定为 0.70、0.92、1.31、4.82、8.78 mg/g。

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(收稿日期:2018-04-08)

(修回日期:2018-04-24;编辑:陈静) 开放科学(资源服务)标识码(OSID)内含全文PDF和增强文件

注:A.黄连阴性对照;B.对照品;C.供试品; 1.表小檗碱;2.黄连碱;3.盐酸巴马汀;4.盐酸小檗碱图 1 胃康宁颗粒中黄连生物碱HPLC 图

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