甘草次酸与茶碱联用的体内及体外平喘作用研究

尉捷,张奇北京城市学院生物医药学部,北京 100083

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 - 通讯作者:张奇,E-mail:[email protected]

摘要:目的 探究甘草次酸与茶碱联合使用的体内、体外平喘作用机制。方法 实验分为空白对照组、模型组、甘草次酸组、不同浓度茶碱组及甘草次酸+茶碱组,ELISA 检测人支气管平滑肌细胞炎症模型细胞内环磷酸腺苷(cAMP)变化;建立离体气管体外模型,比较药物改善乙酰胆碱引发的气管收缩率;建立豚鼠哮喘模型,测定豚鼠延喘时间。结果 各浓度茶碱均可升高细胞内 cAMP 含量,抑制乙酰胆碱引起的体外气管

收缩,延长延喘时间,差异均有统计学意义(P<0.05);甘草次酸单独使用时无显著效果;当二者联合使用时,甘草次酸+茶碱组与相同浓度茶碱组比较,cAMP含量升高,气管收缩率降低,延喘时间增加,差异均有统计

学意义(P<0.05)。结论 甘草次酸与茶碱在平喘治疗中联用,可提高药效,减少茶碱使用量。关键词:茶碱;甘草次酸;平喘;气管平滑肌;豚鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.012

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)12-0045-03

Experimental Study on Effects of Glycyrrhetic Acid Combined with Theophylline for in Vivo and in Vitro Combating Asthma

YU Jie, ZHANG Qi

Department of Biology and Medicine, Beijing City University, Beijing 100083, China

Abstract: Objective To investigate the mechanism of glycyrrhetic acid combined with theophylline for in vivo and in vitro combating asthma. Methods The experiment was divided into blank control group, model group, glycyrrhetic acid group, different concentrations of theophylline groups and glycyrrhetic acid + theophylline group. The intracellular cAMP changes were measured by ELISA method. An in vitro tracheal model was established to compare the effects of medicine on acetylcholine-induced muscle contraction. Guinea pig asthma model was established, and asthmatic time in guinea pigs was detected. Results Theophylline high, medium, and low concentrations could increase intracellular cAMP levels, inhibit acetylcholine-induced tracheal contractions in vitro, and prolong the delay time for asthma, with statistical significance (P<0.05); The glycyrrhetic acid has no significant effect when used alone; When glycyrrhetic acid combined with theophylline, compared with theophylline group of the same concentration, the glycyrrhetic acid + theophylline group had higher cAMP content, lower tracheal contraction rate, and longer delay time for asthma, with statistical significance (P<0.05). Conclusion Glycyrrhetic acid combined with theophylline used in combating asthma can improve efficacy and reduce the dosage of theophylline.

Keywords: theophylline; glycyrrhetic acid; combating asthma; tracheal smooth muscle; guinea pig

茶碱(theophylline)是茶叶中的重要成分,是一种磷酸二酯酶(PDE)抑制剂,常用于哮喘治疗,有舒张支气管平滑肌作用,在血浆浓度小于10 mg/L 时即可对迟发型哮喘反应产生影响,但由于其非选择性抑制,对中枢神经、心血管及胃肠道等系统均表现出一定的不良反应,限制了其临床应用[1]。甘草作为一种补益类中药,有调和诸药之效。甘草含有多种化学成分,其中甘草次酸(glycyrrhetic acid)作为甘草类 化合物发挥实质功效的重要中间物质,有显著的肾上腺皮质激素样作用,具有抗炎、增强机体免疫力、提高生理机能、抑制癌细胞生长等功效,常用于各种原

因引起的上呼吸道感染[2-5]。甘草次酸经肠内微生物作用,部分生成 3-表-甘草次酸及少量 3-脱氢甘草次

酸,进而发挥其活性[6]。本研究分别在细胞、离体组织和动物水平,研究甘草次酸与茶碱联合使用在平喘中的作用,以期在提高或保持茶碱类药物原有治疗效果的情况下,减少茶碱使用量,进而降低其毒副作用,为临床应用提供依据。

材料与方法

1.1动物与细胞株

SPF级英国种豚鼠(短毛种)48只,2月龄,体

质量(350±10)g,雌雄各半,北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号 SCXK(京)20080003。饲养于温度(21±2)℃、相对湿度30%~70%的环境,每日光照12 h,通风良好,自由摄食饮水。人支气管平滑肌细胞株( human bronchial smooth muscle cells,HBSMC),美国 Sciencell 公司。

1.2 药物

甘草次酸(编号 588965)、茶碱(编号 340523)、磷酸组胺(编号H7375)、乙酰胆碱(编号 A0084),百灵威科技有限公司。

1.3 主要试剂与仪器平滑肌细胞培养基(SMCM),美国 Sciencell 公司;环磷酸腺苷(cAMP)ELISA试剂盒,美国BioVision公司;Krebs-Henseleit 缓冲液,美国 Sigma 公司。酶标仪(美国 Bio-rad 公司),恒温平滑肌槽、张力传感器、生物信号采集系统(成都盟泰科技有限公司),超声波雾化器(北京亚都科技股份有限公司)。

1.4 细胞药物处理

将复苏后的 HBSMC 以 SMCM 稀释至 106/mL,加入 96 孔板,100 —L/孔,37 ℃、5%CO2培养,待细胞生长至 80%~90%时,将其分为 9 组。模型组加入终浓度10 —g/mL肿瘤坏死因子-α(TNF-α);空白对照组用SMCM;药物干预组分别在加入终浓度10 —g/mL TNF-α后再加入不同浓度药物,甘草次酸组加入终浓度 10-9 mol/L甘草次酸,茶碱低、中、高组分别加入终浓度 10-9、10-8、10-7 mol/L 茶碱,甘草次酸+茶碱低、中、高组分别加入终浓度10-9、10-8、10-7 mol/L 茶碱和 10-9 mol/L甘草次酸。每组用8 个平行,37 ℃、

5%CO2孵育 12 h。

1.5 环磷酸腺苷测定

参照 cAMP ELISA试剂盒说明书,倾倒上述细胞的培养液,加入150 —L裂解液,充分裂解、静置后,吸取100 —L上清液加入固定有cAMP抗体的酶标板。再加入 100 —L HRP-cAMP,37 ℃孵育 1.5 h,磷酸盐缓冲液充分洗涤,然后加入显色液显色,于 450 nm波长处测定吸光度。以空白对照组为单位1(100%),

以与空白对照组比值×100%计算cAMP,以模型组和各给药组与空白对照组比值表示cAMP的变化情况。

1.6 豚鼠离体气管收缩实验

选 6只豚鼠,击头致昏,剥取气管后,将每只豚鼠气管剪成 4 mm×8 mm 的气管片,分别固定于 Krebs-Henseleit 缓冲液(20 mL)、37 ℃恒温管中,并与张力传感器连接,持续通入 95%O2和 5%CO2的混合气体,静息负荷1g重物后,加入 10-5 mol/L 乙酰胆碱,以生物信号采集系统收集数据,记录最大收缩效应,作为空白对照组。随后,以 Krebs-Henseleit缓冲液反复冲洗该气管片,直至肌张力恢复至基线,

按“1.4项”下药物处理分别加入待测药物和10-5 mol/L乙酰胆碱,以生物信号采集系统收集数据,测量收缩

曲线,计算收缩率[7]。收缩率(%)=(给药前曲线

高度-给药后曲线高度)÷给药前曲线高度×100%。

1.7 磷酸组胺致敏豚鼠哮喘实验将雌雄各半42只豚鼠逐个标记后置玻璃钟罩内,

用超声波雾化器喷入(0.5 mL/min)0.1%磷酸组胺+

2%乙酰胆碱溶液 10 s 引喘,以秒表记录每个豚鼠发生哮喘时间。将豚鼠随机分为空白对照组(予生理盐

水),甘草次酸(0.5 mg/kg)组,茶碱高(5 mg/kg)、

中(2.5 mg/kg)、低(1.25 mg/kg)组,甘草次酸+茶碱中、低组,每组6只,雌雄各半,用超声波雾化器

喷入(0.5 mL/min)不同浓度和配比的药物,连续喷雾 10 s后,用超声波雾化器以相同的速度喷入 0.1%

磷酸组胺+2%乙酰胆碱溶液 10 s 引喘,以秒表记录

豚鼠哮喘潜伏时间,计算延喘时间百分比[8]。

1.8 统计学方法

采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s表示。采用方差分析,组间两两比较用LSD 法。—

P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果2.1 甘草次酸与茶碱联用对人支气管平滑肌细胞株细胞内环磷酸腺苷水平的影响

与模型组比较,茶碱高、中、低组cAMP 水平显

著升高(P<0.05),甘草次酸组升高不明显(P>0.05),当二者联合使用时,与单独使用相同浓度茶碱组比较,cAMP 比例显著升高(P<0.05)。见图 1。

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