草麻黄 HPLC特征图谱研究

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

孙云波 1,2,沈硕 1,宋联强1,张创峰1,田清存3,崔旭盛3,毕丹 1,2

1.北京以岭药业有限公司,北京 102600;2.河北省中西医结合医药研究院,河北 石家庄 050035;

3.石家庄以岭药业股份有限公司,河北 石家庄 050035

摘要:目的 建立草麻黄的 HPLC特征图谱,为其质量标准的制定提供依据。方法 采用 RP-HPLC,色谱柱为 Waters XBridgeTM Phenyl(250 mm×4.6 mm,5 µm),以甲醇-0.092%磷酸(含 0.04%三乙胺和 0.02%二

正丁胺)为流动相,梯度洗脱,0~14 min 流速为 0.8 mL/min,21~60 min 流速为 1.0 mL/min,检测波长 210 nm,柱温 30 ℃,进样体积为10 µL,记录时间为 60 min。结果 HPLC特征图谱的方法学考察结果符合要求,共标定草麻黄 HPLC 特征图谱的 9 个特征峰,指认其中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和盐酸甲基麻黄碱 3 个特征

峰,10 批草麻黄特征图谱的相似度为 0.861~0.982。结论 本研究建立的草麻黄 HPLC 特征图谱可为草麻黄质量标准的建立提供依据。关键词:草麻黄;高效液相色谱法;特征图谱;盐酸麻黄碱;相似度分析;质量标准

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.017

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)12-0067-04

Study on HPLC Specific Chromatograms of Ephedra sinica Stapf.

SUN Yun-bo1,2, SHEN Shuo1, SONG Lian-qiang1, ZHANG Chuang-feng1, TIAN Qing-cun3, CUI Xu-sheng3, BI Dan1,2

1. Beijing Yiling Pharmaceutical Co., Ltd, Beijing 102600, China;

2. Hebei Province Institute of Integrated Traditional and Western Medicine, Shijiazhuang 050035, China;

3. Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Ltd, Shijiazhuang 050035, China

Abstract: Objective To establish an HPLC specific chromatograms of Ephedra sinica Stapf. and to provide a basis for establishment of quality standards of Ephedra sinica Stapf. Methods The RP-HPLC method were adopted, with Waters XBridgeTM phenyl (250 mm × 4.6 mm, 5 µm) as the chromatographic column. Methanol and water containing 0.092% phosphoric acid, 0.04% triethylamine and 0.02% dibutylamine was as the mobile phase for gradient elution. Flow rate of 0–14 min was 0.8 mL/min; flow rate of 21–60 min was 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 210 nm. The column temperature was 30 ℃. The sample volume was 10 µL. The recording time was 60 min. Results The methodological study of HPLC specific chromatograms met relevant requirements. A total of nine characteristic peaks of HPLC specific chromatograms of Ephedra sinica Stapf. were marked, and three characteristic peaks of ephedrine hydrochloride, pseudoephedrine hydrochloride and methylephedrine hydrochloride were identified. Similarities of 10 batches of Ephedra sinica Stapf. were among 0.861–0.982. Conclusion The HPLC specific chromatograms of Ephedra sinica Stapf. can provide a basis for establishment of quality standards of Ephedra sinica Stapf..

Keywords: Ephedra sinica Stapf.; HPLC; specific chromatograms; ephedrine hydrochloride; similarity analysis; quality standards 草麻黄 Ephedra sinica Stapf.为麻黄科植物,是《中华人民共和国药典》收载的中药麻黄的基源植物 之一,与中麻黄 Ephedra intertmedia Schrenk et C.A. Mey.和木贼麻黄 Ephedra equisetina Bge.均为法定正

品药用麻黄[1]。麻黄性温,味辛、微苦,功效发汗解表、利水消肿、宣肺平喘,具有兴奋中枢神经系统、松弛支气管平滑肌、免疫抑制、抗氧化、抗凝血、抗

病毒及抗癌、预防肥胖等作用[2-4]。2015 年版《中华人民共和国药典》规定以盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱

基金项目:国家自然科学基金青年基金(81503231);国家

中药标准化项目(ZYBZH-C-HEB-12 );北京市科技计划“十病十药”研发(Z161100001816022)

通讯作者:毕丹,E-mail:[email protected]

的总质量分数不得少于 0.8%作为麻黄质量控制的标

准[1]。但麻黄化学成分复杂,含有生物碱类、黄酮类、挥发油、有机酚酸类、糖类及鞣质、单萜糖苷类、木

质素类等多种化学成分[3-8],药理作用丰富[7-11]。中药的药效作用是其所含多种成分共同作用的结果,因此仅对上述2种生物碱成分进行定量分析,不能从整体上反映麻黄药材的内在质量。

中药指纹图谱技术作为一种从整体上控制中药质量的手段,已得到广泛应用,该技术能很好地反映色谱峰信息量较大的中药质量,而特征图谱则能更好地反映色谱峰信息量相对较少的中药质量。中药特征图谱具有分析速度快、分离效能高、应用设备普遍的优点,是目前应用最多的一种快速检验药材质量的技术。草麻黄主产地资源丰富,采收较容易,资源易得到保证。本研究对道地产区草麻黄进行质量控制研究,由于草麻黄色谱峰信息量较小,故采用HPLC 进行特征图谱研究,旨在建立草麻黄特征图谱,以有效控制草麻黄药材质量,促进道地产区草麻黄药材生产稳定发展。

1 仪器与试药

Agilent Technologies 1260 series 分析型高效液相色谱仪(DAD 检测器、柱温箱、自动进样器、色谱

工作站),美国安捷伦科技有限公司;AL204 型电子天平,瑞士 Mettler Toledo 公司;AB135-S 型电子天平,瑞士 Mettler Toledo 公司;KQ250DB 型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;Waters XbridgeTM Phenyl 色谱柱(5 µm,4.6 mm×250 mm)。

盐酸麻黄碱对照品(纯度 99.7%,批号 171241201007)、盐酸伪麻黄碱对照品(纯度99.9%,批号

171237-201208 )、盐酸甲基麻黄碱对照品(纯度

99.7%,批号 171247-200301),中国食品药品检定研究院;甲醇(色谱纯),美国 Fisher 公司;磷酸、三乙胺、二正丁胺均为分析纯,水为超纯水(Milli-Q

制备);0.45 µm微孔滤膜,天津市津腾实验设备有限

公司。10批草麻黄药材经石家庄以岭药业股份有限公司中药资源部田清存主任鉴定为草麻黄 Ephedra sinica Stapf.,样本存放于北京以岭药业有限公司,样品来源见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用 Waters XbridgeTM Phenyl 色谱柱(4.6 mm×

250 mm,5 µm),流动相为甲醇(A)-0.092%磷酸(含

0.04%三乙胺和 0.02%二正丁胺,B),梯度洗脱(见表 2),柱温 30 ℃,检测波长 210 nm,进样量 10 µL。

2.2供试品溶液的制备取草麻黄粉末(过5号筛)约 0.3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入1.5%磷酸 25 mL,称定质量,超声处理(功率500 W,频率 40 kHz)30 min,放冷,再称定质量,用 1.5%磷酸补足减失的质量,摇匀,取上清液,用 0.45 µm微孔滤膜过滤,即得。

2.3 对照品溶液的制备取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、盐酸甲基麻黄碱对照品适量,精密称定,加1.5%磷酸制成 40 µg/mL的对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

取同一份草麻黄(S7号)供试品溶液,连续进样

6次,按“2.1”项下色谱条件测定,将所得色谱图导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系

统(2012 版)》,以 5号峰为参照峰(S)计算,各特征峰的相对保留时间RSD 均小于 0.98%,相对峰面积RSD 均小于 2.88%,所得色谱图的 9个特征峰相似度分别为 0.995、0.996、0.996、0.996、0.997、0.987,

RSD=0.38%,表明仪器的精密度良好。

2.4.2 稳定性试验取同一份草麻黄(编号S7)供试品溶液,分别在

0、2、4、6、8、10、24 h进样测定,以5 号峰为参照峰(S)计算,各特征峰的相对保留时间RSD 均小于 1.29%,相对峰面积 RSD 均小于 2.82%,所得的色谱图的9个特征峰相似度分别为 0.994、0.997、0.997、

0.997、0.997、0.994、0.996,RSD=0.14%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验取同一批草麻黄(编号S7),按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,以 5 号峰为参照峰(S)计算,各特征峰的相对保留时间 RSD 均小于 0.11%,相对峰面积 RSD 均小于 2.68%,所得色谱图的 9 个特征峰相似度分别为

0.996、0.999、1.000、1.000、0.999、1.000,RSD=

0.16%,表明本方法重复性良好。

2.5 特征图谱的建立及分析

取 10批草麻黄粉末(过5 号筛),分别按“2.2”

“2.3”项下方法制备供试品溶液和对照品溶液,按

“2.1”项下色谱条件进行检测,记录色谱图(见图1)。共标定草麻黄HPLC 特征图谱的9个特征峰,将供试品溶液与对照品溶液色谱峰的保留时间及紫外吸收光谱图进行比对,指认了其中3个色谱峰,分别为盐

酸麻黄碱(5号峰)、盐酸伪麻黄碱(6号峰)和盐酸

甲基麻黄碱(7 号峰)。将所得 10 批草麻黄样品的HPLC 特征图谱以AIA格式导入《中药色谱指纹图谱

相似度评价系统(2012版)》,选定 S7号样品的色谱图为参照图谱,设定时间漂移值为 0.1,采用中位数法谱峰自动匹配,进行多点矫正,得到 10 批草麻黄样品叠加图谱及对照图谱(见图2)。将生成的对照图谱(R)的相似度定为 1,计算草麻黄样品特征图谱的相似度,结果其相似度为 0.861~0.982,见表 3。以 5号峰盐酸麻黄碱为参照峰(S),计算各特征峰与S 峰的相对保留时间,结果见表 4。将相对保留时间

的平均值作为规定值,9 个共有峰相对保留时间均在

规定值±5%范围内。 3 讨论

本试验采用HPLC-DAD检测器进行全波长扫描,比较 190~400 nm所得的特征图谱,结果在210 nm检测的色谱图中色谱峰最多,因此确定检测波长为

210 nm。试验考察了不同色谱柱温度(25、30、35 ℃)所得的特征图谱,结果表明色谱柱温度为 30 ℃时,色谱图中色谱峰数量最多且分离效果最好。

本试验比较了不同的流动相,如甲醇-0.2%磷酸、

甲醇-水、甲醇-0.092%磷酸(含 0.04%三乙胺和 0.02%

二正丁胺)、乙腈-0.2%磷酸,结果显示甲醇-0.092%磷酸(含 0.04%三乙胺和 0.02%二正丁胺)的分离效果较好,故以此为流动相进行梯度洗脱。在该色谱条

件下增加有机相梯度洗脱比例,并延长洗脱时间至

120 min,结果表明 60 min后没有明显的色谱峰,因此流动相洗脱时间确定为60 min,方法学考察验证了该色谱条件的可行性。因此,该色谱条件可用于建立草麻黄 HPLC 特征图谱。

本试验比较了不同提取溶剂,如水、1.5%磷酸、

50%甲醇、50%甲醇(含 1.5%磷酸)、甲醇、甲醇(含

1.5%磷酸),结果表明 1.5%磷酸作为提取溶剂所得的特征图谱中色谱峰最多、峰面积较大,因此选择1.5%磷酸作为提取溶剂。本试验还考察了加热回流和超声法 2种提取方法,结果表明2种方法所得特征图谱色谱峰的强度与数目无明显差异,而超声提取方法简便,因此选择超声提取。同时,比较了超声提取20、

30、40 min 的效果,结果表明超声提取 30、40 min所得特征图谱中色谱峰数量较超声提取20 min 多,且提取 30 min 和 40 min所得特征图谱的色谱峰无明显差异,因此最终确定超声提取时间为30 min。

本试验采用 HPLC-DAD 梯度洗脱建立了草麻黄特征图谱的分析方法,同时对色谱条件和供试品溶液的制备方法进行了优化,并进行了方法学考察,结果显示精密度、重复性、稳定性相对保留时间的 RSD均小于 2%,相对峰面积的 RSD 均小于 3%,表明该方法准确、可靠、重复性良好。测定 10 批草麻黄的HPLC特征图谱,运用《中药色谱指纹图谱相似度评

价系统(2012版)》软件进行分析,得到9个共有峰。比较 10 批草麻黄 HPLC 特征图谱中特征峰的相对保留时间,并计算相似度,结果表明不同批次草麻黄HPLC特征图谱的特征峰相对保留时间在规定值范围内,相似度为 0.861~0.982,10 批草麻黄有较好的相似度。

本研究建立了草麻黄药材特征图谱检测方法,并对不同批次草麻黄药材特征图谱进行分析比较,为草麻黄药材质量标准的制定及鉴别提供了依据。

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(收稿日期:2018-01-24)

(修回日期:2018-03-23;编辑:陈静)

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