金樱子 HPLC指纹图谱研究

2018-12-15 -

胡莹 1，2，吴啟南 2

1.南京中医药大学附属医院，江苏南京 210029；2.南京中医药大学，江苏省中药资源产业化协同中心/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏南京 210023

摘要：目的建立金樱子指纹图谱，为提高金樱子质量标准奠定基础，为规范金樱子饮片市场及确保药材内在质量的均一性和稳定性提供较全面的质量控制手段。方法采用 HPLC 结合《中药色谱指纹图谱相似度

评价系统（2012版）》对金樱子指纹图谱进行相似度评价并建立共有模式，采用SPSS19.0 软件进行聚类分析。结果初步建立了金樱子HPLC指纹图谱，确定了10个不同产地金樱子指纹图谱的9个共有峰。结论本方法建立的 HPLC指纹图谱可用于金樱子质量评价。关键词：金樱子；芦丁；高效液相色谱法；指纹图谱；聚类分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.018

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)12-0071-05

Study on Fingerprint of Rosae Laevigatae Fructus

HU Ying1,2, WU Qi-nan2

1. Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China; 2. Nanjing University of Chinese Medicine, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Nanjing 210023, China

Abstract: Objective To establish the fingerprint of Rosae Laevigatae Fructus; To lay a foundation for improving the quality standard of Rosae Laevigatae Fructus; To provide a comprehensive quality control method for the market standardization of Rosae Laevigatae Fructus sample to ensure the quality of medicinal materials internal homogeneity and stability. Methods HPLC method and TCM Chromatogram Fingerprint Similarity Evaluation System (2012 edition) were used to evaluate the similarity and establish the common mode of Rosae Laevigatae Fructus, and the

SPSS19.0 software was used for cluster analysis. Results The HPLC fingerprint of Rosae Laevigatae Fructus was established, and a total of 9 common peaks of Rosae Laevigatae Fructus from 10 different producing areas were marked. Conclusion The HPLC fingerprint established in this study can be used for the quality evaluation of Rosae Laevigatae Fructus.

Keywords: Rosae Laevigatae Fructus; rutin; HPLC; fingerprints; cluster analysis

金樱子 Rosa Laevigata Michx.系蔷薇科蔷薇属植物，果实入药名金樱子。现代研究表明，金樱子对烧烫伤、皮肤肿瘤、神经性头痛、神经衰弱都具有很好

的疗效。现代药理研究显示，金樱子具有抗肿瘤[1]、

抗氧化[2-3]、抗病毒、降血糖、降血脂等作用[4]。文献报道，金樱子果实主要含三萜类、黄酮类及多糖类等

活性物质化学成分[5-6]。其他营养成分还包括维生素 C、B1、B2及胡萝卜素等多种维生素、矿物质、脂肪酸和氨基酸。金樱子含有的芦丁具有维生素P类作用，能够降低毛细血管通透性和脆性，维持血管正常弹性，具有抗炎、抗病毒作用。本研究选择芦丁作为指标成分，测定其含量，建立金樱子HPLC 指纹图谱，用于 10 个不同产地金樱子的模式识别研究，通过选择保留时间、峰高、峰面积等作为数字特征，确立其共有模式，为提高金樱子质量标准奠定基础，并为规范金樱子饮片市场及确保药材内在质量的均一性和稳定性提供较全面的质量控制手段。仪器与试药

美国安捷伦 1260 高效液相色谱仪（美国惠普公

基金项目：国家科技支撑计划（2011BAI04B06）；国家公益性

行业专项（201407002）；国家公共卫生行业专项（2014002）；

江苏高校优势学科建设工程资助项目（2014年）

通讯作者：吴啟南，E-mail：qnwyjs@163.com

司），包括 DEABL00204 低压四元泵、DEAAK03494

柱温箱、DEAAN00315 自动进样器、DEAAX00613

紫外检测器；BP112 型电子天平（德国 Satorius 公司）； Milli-Q GradientA10 超纯水器（Millipore Inc. USA）

芦丁对照品（批号 110831-201204）、金樱子对照药材（批号 121047-201204），中国食品药品检定研究院；乙腈（Tedia美国，色谱纯），甲醇（上海化学试剂有限公司），醋酸（上海化学试剂有限公司），双蒸水为本实验室制备并经过0.45 µm滤膜过滤。金樱子样品来源于 10 个产地，经南京中医药大学吴啟南教授鉴定为蔷薇科植物金樱子Rosa Laevigata Michx.的干燥成熟果实，来源信息见表1。 2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用安捷伦 Hedera ODS-3 色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 µm），流动相为乙腈（A）-0.5%醋酸水（B），梯度洗脱（见表2），流速1.0 mL/min，检测波长370 nm，柱温 30 ℃，进样量10 µL，分离时间 60 min。

2.2对照品溶液的制备精密称定芦丁对照品 0.05 g，置于 50 mL棕色量瓶中，以甲醇溶解，超声10 min并定容至刻度，即得芦丁对照品溶液，置于冰箱4 ℃冷藏，备用。

2.3 供试品溶液的制备精密称取金樱子样品粉末（过60 目筛）10 g，精密加 70%甲醇 100 mL 于 250 mL具塞锥形瓶中，水

浴（90 ℃）回流提取1 h，过滤，药渣及滤纸同置于锥形瓶中，加70%甲醇 100 mL，水浴（90 ℃）回流提取 1 h，过滤，用70%甲醇洗涤药渣及滤纸，合并滤液和洗液，置于蒸发皿中挥去部分溶剂，加70%甲醇定容至5 mL 量瓶中，0.45 µm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 空白试验

精密吸取空白溶液（甲醇）10 µL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行洗脱，结果溶剂在前

5 min出峰完毕，即空白不干扰测定。

2.4.2 分析时间确定取供试品溶液进样，在60 min后已无大量成分残留，确定金樱子指纹图谱的分析时间为60 min。

2.4.3 精密度试验

取同一批金樱子样品（S10）溶液6 份，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，计算色谱峰相似度。结果 9个共有峰相似度＞0.95，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验

取同一批金樱子样品（S10）溶液，室温放置，

按“2.1”项下色谱条件分别于 0、2、4、6、8、12、

24 h进样分析，计算色谱峰相似度。结果9个共有峰

相似度＞0.95，表明供试品溶液在 24 h内稳定。

2.4.5 重复性试验

取同一批金樱子样品（S10）6 份，按“2.3”项

下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件平行测定，计算色谱峰相似度。结果9个共有峰相似度＞

0.95，表明本方法重复性良好。

2.5 样品测定

精密吸取按“2.3”项下方法制备的 10 个不同产地金樱子供试品溶液和金樱子对照药材溶液各10 µL，

按“2.1”项下色谱条件进样分析。

2.6 指纹图谱的建立

2.6.1 共有峰的确定

10个产地金樱子HPLC色谱图测定结果显示，主要有 9 个共有峰。选择 5 号峰作为参照峰，得到 10个产地金樱子和金樱子对照药材9个共有峰的相对保留时间与相对峰面积。除5号峰外，其他8个峰相对保留时间依次为 0.57、0.93、0.95、0.97、1.02、1.03、

1.10、1.29，各共有峰相对较稳定，具有指纹图谱特征性。经与对照品图谱（见图1）比对，确定 5 号峰为芦丁色谱峰，其峰面积超过总峰面积的20%，为第一大峰，范围在 28.844%～54.995%之间。

2.6.2 共有模式的建立与相似度分析采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度

评价系统（2012 版）》进行相似度评价并建立共有模式。将数据导入软件，通过选峰设定匹配模板，将导入的色谱峰自动匹配，建立共有模式（见图 2）及指纹图谱叠加图（见图3），进行谱峰差异性评价和整体性评价，结果见表 3。分别以指纹图谱共有模式和金樱子对照药材为对照，计算 10 个产地金樱子样品指纹图谱的相似度，结果见表4。

分析可知，S1（湖北宜昌）、S4（贵州毕节）、S7

（四川大巴山）相似度较差，S3（湖南怀化）与对照药材最为接近。虽然各产地金樱子样品保留时间并没有出现较为明显的差异，但各共有峰的峰面积却存在差异。由于本研究收集的金樱子样品都是在同年10～

11月果实成熟期采收的，所以其差异可能是由产地气候、土壤、光照、水分等因素导致的。具体原因需要根据采收地的天气情况、土壤成分分析、水分分析等进一步研究。

2.6.3聚类分析

运用 SPSS19.0 软件对10个产地金樱子样品进行系统聚类，以夹角余弦作为样品相似度的距离公式，利用组间连结方法，得到聚类分析结果（见图4）。通

过聚类分析将金樱子样品分为质量好的Ⅰ类（S6、S8、

S9、S5）、质量较好的Ⅱ类（S2、S3、S10）、质量较

差的Ⅲ类（S4、S7）和质量最差的Ⅳ类（S1）。Ⅰ类和Ⅱ类的夹角余弦均在 0.9 以上，而质量最差的Ⅳ类夹角余弦只有0.32，与其他 3类样品相差较大。

将《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》评价结果与利用 SPSS19.0 统计软件聚类分析结果进行比较，二者较为一致，可相互验证。根据2种

分析方法的计算结果，相似度＞0.9的样品（S6、S8、

S9、S5）为金樱子的推荐品，质量较好；相似度＜0.9的样品为非推荐品，质量较差，以S1 最差。

2.7芦丁含量测定

2.7.1精密度试验

精密吸取 0.05 µg/mL 芦丁对照品溶液10 µL，按

“2.1”项下色谱条件重复进样6次，结果峰面积RSD＜

5%，表明精密度良好。

2.7.2 稳定性试验

精密吸取 0.05 µg/mL 芦丁对照品溶液10 µL，按

“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样分析，结果峰面积 RSD＜5%，表明本方法稳定性良好。

2.7.3 重复性试验

取同一批金樱子样品，按“2.3”项下方法平行制备 6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果峰面积RSD＜5%，表明本方法重复性良好。

2.7.4 线性关系考察分别吸取不同浓度芦丁对照品溶液进样分析，制作标准曲线，得线性回归方程 Y＝2538.0X＋59.873，

r²＝0.999 1。结果表明，在 0.02～1 µg范围内，芦丁进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.7.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的金樱子样品（S7）2 g，精密

称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分成 6份，分别加入一定浓度的芦丁对照品溶液，按上述色谱条件进样分析，计算加样回收率，结果见表5。

2.7.6样品含量测定

取 10 个不同产地的金樱子样品和金樱子对照药

材，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果见表 6。S2（广西桂林）、

S5（江西抚州）含量较高。

讨论本试验首先对提取工艺进行优化，考察了不同体积分数甲醇和乙醇回流提取，以及超声与回流提取的效果，结果70%甲醇回流提取 2 h得到的色谱峰信息最佳。金樱子中各类成分在 260、273、370 nm 波长附近均有较大吸收，但在 370 nm处的特征峰相对较多且峰值最大，基线也较为平稳，故选择370 nm 作

为金樱子指纹图谱检测波长。本试验分别以乙腈0.5%醋酸水溶液、甲醇-0.5%醋酸水溶液、乙腈-0.5%

甲酸水溶液、甲醇-0.5%甲酸水溶液为流动相进行梯

度洗脱，结果乙腈-0.5%醋酸水溶液系统的洗脱效果在分离度及峰型上都最佳，出峰数也最多。同时，将分离时间加长至2倍，结果色谱图显示60 min 后无其他色谱峰出现，从而确定梯度洗脱时间为60 min。

金樱子化学成分种类多且复杂，仅测定单一或多个有效成分的含量无法全面反映其质量，因此，建立系统、全面、完整的特征指纹图谱对金樱子药材质量评价十分必要。本试验建立金樱子HPLC 指纹图谱，确定了 10 个不同产地金樱子的 9 个共有峰。以各产地间峰面积相对百分含量初步拟定特征指纹峰，以5、

7、9号峰为强峰。利用《中药色谱指纹图谱相似度分

析系统（2012 版）》对 10个产地金樱子进行比对，得出结果：若以共有模式作为对照，各产地样品的相似度在0.246～0.984之间；若以金樱子对照药材为对照，相似度在 0.271～0.979 之间。10个不同产地的金樱子样品存在较大差异，尤以S1（湖北宜昌）、S4（贵州

毕节）、S7（四川大巴山）差异最为明显。通过与对照品比对，得出5号共有峰为芦丁。通过含量测定发现，不同产地样品芦丁含量存在明显差异。今后将对其他共有特征峰的鉴别、其他主要成分在样品中的含量的差异性进一步进行研究。

通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》和 SPSS19.0 聚类分析进行相互验证，得出相同结论。不同产地金樱子样品虽然采收季节相同，其主要色谱峰大体一致，但由于不同的地理环境、土壤、气候等影响，可能存在一些差异，表现为同一色谱条件下色谱图上峰位差异，不同产地金樱子的质量也存在差异，表现在同一保留时间具有不同的峰面积。我们通过液质联用分析手段进一步确定各主成分含量

的差异性，结果表明与含量测定结果基本一致，S1、

S4 质量较优。本试验建立的金樱子 HPLC 指纹图谱为金樱子的质量评价奠定了基础。

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