CJI (Traditional Chinese Medicine)
胃炎康方对慢性非萎缩性胃炎患者胃泌素相关基因调控通路影响
彭艳红1，蒋亦昕2，白光1，王庆峰 3
1.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁经济职业技术学院，辽宁 沈阳 110032；
3.沈阳师范大学，辽宁 沈阳 110032
摘要：目的 采用网络药理学预测胃炎康方的作用靶点，以临床样本验证该靶点的准确性，确定胃炎康方的分子机制。方法 采用随机数字表法将112例慢性非萎缩性胃炎患者分为治疗组和对照组各56 例。对照组采用西医常规治疗；治疗组予胃炎康方，每日1剂，水煎，每日2 次口服。2组均连续治疗4周。分析2组临床疗效。采用生物信息学手段挖掘胃炎康方潜在调控基因，预测其作用于胃炎的靶点。应用免疫组化法分析胃部组织样本以验证胃炎康方的作用机制。结果 治疗组总有效率为 87.5%（49/56），对照组为 78.6%（44/56），
2 组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。胃镜显示 2组胃部病理学结构均好转，差异无统计学意义（P＞0.05）。通过网络药理学对胃炎康方作用的靶基因进行预测，其胃泌素相关的靶基因包括前列腺素G/H 合成酶2、B细胞 κ 轻肽基因增强子抑制因子、磷脂酰肌醇-3 激酶催化亚基 δ 及前列腺素 F2α 受体。并预测胃炎康方可基由
PTGS2→IKBKB 的信号通路，抑制胃泌素所致的炎症反应。通过胃炎康方治疗的临床样本分析，基本验证以上推论。结论 胃炎康方通过对 PTGS2、IKBKB、PIK3CD、PTGFR 等靶基因的调控激活相应信号通路而发挥治疗作用。采用网络药理学手段可快速预测复方作用靶点，应用该方法可解释复方对相关疾病的治疗机制，并提供新的研究手段。关键词：网络药理学；生物信息学；慢性非萎缩性胃炎；基因靶点；信号通路
中图分类号：R259.733.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)02-0042-05
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.010 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Effect of Weiyankang Prescription on Gastrin-related Gene Regulation Pathway of Chronic Non-atrophic Gastritis
PENG Yanhong1, JIANG Yixin2, BAI Guang1, WANG Qingfeng3
1. Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, China; 2. Liaoning College of Economics and Technology, Shenyang 110032, China; 3. Shenyang Normal University, Shenyang 110032, China
Abstract: Objective To predict the targets of Weiyankang Prescription by means of network pharmacology; To verify the accuracy of the targets with clinical samples to determine the molecular mechanism of Weiyankang prescription. Methods Totally 112 cases of chronic non-atrophic gastritis were divided into treatment group and control group, with 56 cases in each group. The control group was treated with Western medicine, and the treatment group was given Weiyankang Prescription, one dosage a day, decoction, orally twice a day. All were treated continuously for 4 weeks. The bioinformatics method was used to mine the potential regulatory genes of Weiyankang Prescription and predict its target in the treatment of gastritis. The gastric tissue samples were analyzed by immunohistochemistry to verify the mechanism of Weiyankang Prescription. Results The total effective rate was
87.5% (49/56) in the treatment group and 78.6% (44/56) in the control group, without statistical significance
(P>0.05). Gastroscopic examination showed that the pathological structure of the stomach in both groups improved, without statistical significance (P>0.05). The target genes of Weiyankang Prescription were predicted by network
基金项目：沈阳市科技计划项目（18-013-0-44）；北京市医学科学研究基金（A220）；辽宁省自然科学基金（20170540609）；国
家中医药管理局第三届国医大师传承工作室及全国名中医传承工作室建设项目（2018年）
通讯作者：白光，E-mail：lnzyxhk@126.com
pharmacology. The gastrin-related target genes included: prostaglandin G/H synthetase 2, B cell kappa light peptide gene enhancer inhibitor, phosphatidylinositol-3 kinase catalyzes the subunit δ and prostaglandin F2α receptor. It was predicted that Weiyankang Prescription could inhibit the inflammatory response caused by gastrin by the signal pathway of PTGS2→IKBKB. Through the analysis of clinical samples of Weiyankang Prescription treatment, the above inferences were basically verified. Conclusion Weiyankang Prescription can activate the corresponding signal pathway by regulating the target genes of PTGS2, IKBKB, PIK3CD and PTGFR, to realize the treatment of chronic gastritis. The use of network pharmacology can quickly predict the target of the compound acting on the disease. This method provides a new means to explain the therapeutic mechanism of compound prescription for related diseases.
Keywords: network pharmacology; bioinformatics; chronic non-atrophic gastritis; gene targets; signal pathway
慢性非萎缩性胃炎（chronic non-atrophic gastritis， CNAG）表现为胃部黏膜处慢性炎症细胞浸润，并未伴随胃黏膜萎缩性病变，仅影响胃黏膜表层上皮，未至胃黏膜深处腺体。CNAG日久会导致萎缩性胃炎，引发胃黏膜固有腺体萎缩、肠上皮化生及不典型增生等，增加进一步癌变的风险。CNAG发病机制目前尚不明确，其发病原因与幽门螺杆菌（Hp）感染，胆汁反流，血管活性因子、细胞因子失调及免疫相关因素
等有关[1]。该病分子靶点涉及血管活性肠肽[2]、趋化因子 10[3]，及白细胞介素（IL）-11[4]等。林志强等[5]研究表明，TLR 信号通路在 CNAG 发病过程中具有调控作用。胃炎康方为辽宁中医药大学附属医院（以下简称本院）院内制剂，功效疏肝泄热、和胃止痛。为探讨该方改善胃部炎症的路径，本研究对胃炎康方进行网络药理学分析，获取其潜在作用靶点，并通过string 数据库找到同上述潜在靶点相关的互作基因，并检测胃黏膜样本，明确上述基因的调控情况，以探究胃炎康方作用机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择本院消化内科 2017 年 1 月－2018 年 1 月CNAG 患者 112例，采用数字随机表法分为对照组和治疗组各 56 例。对照组男性 36 例，女性 20 例，平均年龄 48.6 岁；治疗组男性31 例，女性 25 例，平均年龄 49.2 岁。2组患者一般资料比较差异无统计学意
义（P＞0.05）。本研究经由本院伦理委员会审查批
准[2017028ND（KT）-031-07]。
1.2 诊断标准
[6]
参照《中国慢性胃炎共识意见（2017 年，上海）》及《慢性胃炎内镜的分型分级标准及治疗的试行意
见》[7]确定诊断标准。①病程较长，且均呈现各种程度的胃脘胀痛；②胃部感觉胀满，厌食，餐后出现恶心反酸；③内窥镜确诊胃部炎症，目镜下可见胃部黏膜有红斑、黏膜皱襞变平甚至消失，胃部黏膜水肿或 有渗出，可见血管透出；④胃部经内窥镜确认，无萎缩症状发生。
1.3 排除标准
①伴胃部萎缩性病变者；②3 个月内出现消化系统感染者；③存在其他免疫系统疾病史者；④伴癌症、器官衰竭等严重疾病者；⑤伴精神疾病及不愿配合本研究开展者。
1.4 治疗方法对照组采用常规西医治疗（克拉霉素、奥美拉唑、曲昔匹特）。治疗组予胃炎康方（黄连 10 g、蒲公英
15 g、栀子15 g、黄芩10 g、佩兰10 g、佛手10 g、陈皮 10 g、砂仁 10 g、白术 10 g、甘草5g，本院药剂科制备），水煎服，每日1剂，每日2 次口服。2组均治疗 4 周。
1.5 疗效标准
参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》[8]制定。临床痊愈：临床症状体征消失，胃镜复查及病理组织活检证实黏膜慢性炎症明显好转达轻度；显效：临床主要症状体征消失，胃镜复查及病理组织活检证实黏膜慢性炎症好转；有效：主要症状、体征明显减轻，胃镜复查及病理组织活检证实慢性炎症减轻
1 个级度以上；无效：临床症状无改善，胃镜复查及病理组织活检证实黏膜慢性炎症无变化或加重。
1.6 网络药理学分析根据药物的君臣佐使构成，将胃炎康方分为4个
簇（cluster）。cluster1 为君药蒲公英、栀子；cluster2
为臣药黄连、黄芩、佩兰、佛手；cluster3 为佐药陈
皮、砂仁、白术；cluster4 为使药甘草。以 BATMANTCM数据库对胃炎康方进行模拟以获得其作用靶点，其中，设定划界分数为 20 ， P 值为 0.05。根据BATMAN-TCM 数据库所获得的数据挖掘结果，对所获得的靶基因进行 KEGG 及 GO 分析，推测其对应的疾病/基因/信号通路信息，并进一步进行功能富集。
1.7 靶基因及信号通路验证
PTGS2（abcam公司，Anti-COX2/Cyclooxygenase2抗体，兔单克隆抗体，批号 ab21704），IKBKB（abcam公司，Anti-IKKα＋IKβ 抗体，兔单克隆抗体，批号
ab178870），PIK3CD（天津赛尔生物技术有限公司
PIK3CD 抗体，兔单克隆抗体，批号 SRP01115）， PTGFR（abcam 公司 Anti-PTGFRN 抗体，兔多克隆抗体，批号 ab224392）。
患者治疗前后经内窥镜取胃黏膜组织，首先进行
样品预处理，常规免疫组化法进行测定[9]。组织冷冻
切片后，常规二甲苯脱蜡，水化；3%H2O2处理 15 min
封闭内源性的过氧化物酶，5%山羊血清处理 30 min封闭非特异性结合位点；以抗体进行孵育，稀释比例
1∶100，过夜。再按说明书选用对应的免疫组化检测试剂孵育，常规 DAB 染色，苏木精复染，脱水透明
后封片。免疫组化染色结果判定[10]：随机抽选片内5
高倍视野（×400）进行观察，无染色阳性细胞计0
，染色阳性细胞百分率＜10%计 1 分，10%～50%
2 分，＞50%～80%计 3 分，＞80%计4分。根据多阳性细胞呈现的染色强度计分：无着色计 0 分，淡色计 1 分，棕黄色计2 分，棕褐色计3 分。病理阅片及染色积分判定由2名病理医师采用双盲评估法观察完成。计算染色强度积分与阳性细胞百分率积分的
乘积，＜6分判为低表达，≥6 分判为高表达[11]。
1.8 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。组间比较采
用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。2 结果
2.1 2组临床疗效及胃镜结果比较
2 组总有效率比较，差异无统计学意义（P＞
0.05），见表 1。
胃镜显示，2 组患者治疗前胃镜下见黏膜皱襞变平甚至消失，黏膜红白相间，以白色为主，可见血管
透出，炎症反应明显。2 组治疗后患者胃部病理学结构均有好转，可见炎症好转或消失，血管无透出，黏膜皱襞恢复。
2.2 胃炎康方靶基因及信号通路预测
如图 1所示，胃炎康方君臣佐使4个簇中，重叠的靶基因共计 254个。进一步对所获得的数据进行分析，以确定其改善胃炎症状的信号通路。
最终推知胃炎康方作用于CNAG的主要靶点集中在以下方面。①炎症抑制：主要基于核因子-κB（NF-κB）信号通路，调控的靶点为基因 IL-1β→NF-κB；②Hp所致胃炎机制调控：主要基于对 IL-1β 的调控作用；
③胃泌素调控通路[13]：主要基于 PTGS2、IKBKB、
PIK3CD、PTGFR 基因实现对胃酸分泌抑制的调控。其基因互作关系见图 2A（string 数据库），预测作用于胃泌素信号通路的方式见图2B（OmicsNet 数据库）。
2.3临床样本验证选择部分患者胃黏膜组织进行HE染色（见图3），依据全部的观察组染色片，对 PTGS2、IKBKB、
PIK3CD、PTGFR 基因在治疗组治疗前后的高表达情况制作维恩图，见图4。
注：A.治疗前；B.治疗后图4 胃炎康方治疗前后患者胃黏膜组织内靶基因高表达分布
由图 4A可知，治疗前2例患者的4个对应靶基因均呈现高表达状态。有患者亦出现了3 个或2个靶基因重叠高表达状态。表明所选定的靶点基因与CNAG高度相关。由图4B可知，治疗后患者临床症状好转，靶基因表达大幅下降，在患者组织样本内呈现低表达或表达抑制，未出现3 个或4个靶基因重复高表达，2 个以上靶基因重复高表达的样本也大幅降 低（由 15 例降低至3 例）。治疗后，PIK3CD、PTGFR表达均大幅下降，仅1例患者呈现PIK3CD高表达（治疗前为 15 例），2 例患者呈现 PTGFR 高表达（治疗前为 22 例）。
讨论
CANG 为胃黏膜上皮遭受反复损害导致固有腺体的减少，或伴纤维替代肠腺化生和/或假幽门腺化生。发病过程为正常胃黏膜→Hp 感染→急性 Hp感染→慢性 Hp 感染→非萎缩性胃炎→萎缩性胃炎→
肠上皮化生→上皮内瘤变[13]，可见，Hp 参与了关键环节。人体感染 Hp 后，胃泌素生成明显增加，刺激
酸分泌[14]，从而诱发/加重胃炎症状。故治疗上除根除 Hp外，还应阻遏胃泌素诱发胃部炎症反应。
本研究显示，患者胃部病理学特征明显改善。为进一步确定其作用机制，我们应用网络药理学手段对胃炎康方进行分析。基于结果预测可知，胃炎康方直接抑制炎症，或基于 IL-1β 分子抑制 Hp 所致的胃部炎症。根据临床样本免疫组化结果可知，胃炎康方主要作用于 PTGS2、IKBKB、PIK3CD、PTGFR。PTGS2为双功能酶，作为前列腺素内氧化酶还原酶，具有环氧化酶和过氧化氢酶活性，可催熟花生四烯酸转化为前列腺素，在胃炎发病的过程中常同胃泌素表达呈正相关。有研究显示，随着 Hp 的感染与刺激，患者体
胃泌素不断分泌[15]，PTGS2 在胃部组织内表达亦会
上调[16]，从而增加组织内前列腺素含量，诱发炎症反应。从 OmicsNet 及 string 数据库的预测结果可以看，作为 PTGS2 的下游蛋白，IKBKB的表达会随着
TGS2 表达上/下调而上/下调。二者相关性亦在巨噬
细胞的药物实验中得到验证[17]。
IKBKB 是复合物中介导 NF-κB 活化经典途径的
关键上游蛋白[18]，NF-κB 又介导后续的炎症反应。
K3CD 同上游蛋白的 IKBKB 互相作用，虽并未在炎患者的人体内证实，但二者密切相关，常出现于
胰岛素代谢异常的患者体内[19]。研究显示，PIK3CD在胃癌的发病过程中起到了重要作用，常在胃癌患者
的癌旁组织内过表达[11，20-21]。而且，其在消化系统癌患者的发病过程中与 IKBKB 的表达存在相关性[22]。本研究显示，虽然在患者体内IKBKB表达出现异常，仅 2例出现 PIK3CD高表达异常，且治疗后均呈现明
显下调趋势。由此推测，IKBKB→PIK3CD在萎缩性炎→肠上皮化生→上皮内瘤变的阶段发挥了重要作用。
同 IKBKB→PIK3CD 类似，PTGFR表达仍较低， PTGFR 的过表达常出现于肿瘤或炎症患者，其可通
过 ROCK 途径参与胆管等器官纤维化过程[23-24]。其上游启动子为 COX 等酶类。在本研究中，PTGS2 与PTGFR 的表达关系密切。可以推测，随着萎缩性胃
炎的发生，PTGS2 会进一步上调 PTGFR，发生胃壁纤维化，从而介导后续的肠上皮化生。鉴于本研究仅以 CNAG 患者为样本进行研究，无法确认 PIK3CD及 PTGFR 与患者胃炎发病分级间的相关性，其相互关系尚需进一步研究。
综上所述，胃炎康方可显著下调患者黏膜
PTGS2、IKBKB 表达，进一步调节二者下游PIK3CD、PTGFR，由此改善患者胃炎症状。
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