活血散结方药物血浆对PDGF干预下兔视网膜色素上皮细胞增殖相关因子及 ERK1/2 信号转导通路的影响

刘晓清1，彭俊2，张又玮1，谭涵宇1，李建超3，吴权龙2，彭清华 1

1.湖南中医药大学中医眼科学重点学科，湖南 长沙 410208；

2.湖南中医药大学第一附属医院眼科学重点学科，湖南 长沙 410208；

3.西安市中医医院，陕西 西安 710021

摘要：目的 观察活血散结方对血小板源性生长因子（PDGF）干预下兔视网膜色素上皮（RPE）细胞增殖的影响，探讨其分子机制。方法 以 RPE细胞为研究对象，体外进行RPE细胞原代培养及传代，建立PDGF干预下兔 RPE细胞增殖模型，并选取PDGF最佳干预浓度。制备活血散结方药物血浆，对兔RPE细胞增殖与

毒性的影响进行测定，选取最佳的实验浓度。实验分为空白对照组（DMEM）、正常血浆组、PDGF（10 μg/L）

组、PDGF（10 μg/L）＋AG1296（10 μmol/L）组、PDGF（10 μg/L）＋10%药物血浆组、PDGF（10 μg/L）＋

20%药物血浆组。分别加入相应处理因素干预48 h，Transwell 流式细胞仪检测细胞周期变化；Western blot 检测兔 RPE 细胞 cyclin D1 蛋白、pERK1/2 及 ERK1/2 蛋白表达。结果 10%、20%活血散结方药物血浆对 RPE细胞周期、cyclin D1蛋白及 pERK1/2、ERK1/2 蛋白有抑制作用，与 AG1296 抑制剂作用相当（P＞0.05），与

其他组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论 活血散结方药物血浆可能通过影响 ERK 信号通路及对周期蛋白的调控，抑制PDGF 干预下兔 RPE细胞增殖。

关键词：活血散结方；药物血浆；视网膜色素上皮细胞；细胞周期；血小板源性生长因子；cyclin D1 蛋

白；pERK1/2 蛋白；ERK1/2 蛋白

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)02-0062-07

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.014 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Plasma Containing Invigorating Blood and Dissipating Masses Chinese Medicine on Cell Proliferation-Related Factors and ERK1/2 Signal Transduction Pathway in Rabbit RPE Cell Intervened by PDGF

LIU Xiaoqing1, PENG Jun2, ZHANG Youwei1, TAN Hanyu1, LI Jianchao3, WU Quanlong2, PENG Qinghua1

1. Key Discipline of Chinese Ophthalmology, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China;

2. Key Discipline of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha

410208, China; 3. Xi’an Traditional Chinese Medicine Hospital, Xi’an 710021, China

Abstract: Objective To investigate the effect of plasma containing invigorating blood and dissipating masses Chinese medicine on proliferation of rabbit RPE cells treated with PDGF; To discuss the molecular mechanism. Methods The RPE cells were used as the research object and the primitive culture and subculture of RPE cells were proceeded. Rabbit model of RPE cell proliferation treated with PDGF was established, and the best PDGF intervention concentration was chosen. Plasma containing invigorating blood and dissipating masses Chinese medicine was prepared. The effects of rabbit RPE cell proliferation and toxicity were determined, and the best experimental concentration was selected. The experiment was divided into blank control group (DMEM), normal plasma group, PDGF (10 μg/L) group, PDGF (10 μg/L) + AG1296 (10 μmol/L) group, PDGF (10 μg/L) + 10% drug

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81774372）；湖南省自然科学基金（2016JJ6111）；湖南省中医药管理局科研项目（201622）；

湖南省研究生科研创新项目（CX2016B377、CX2017B432）；中医药防治五官科疾病湖南省重点实验室建设项目（2017TP1018）；

长沙市科技计划项目（kc1704005）；湖南省中医五官科学重点学科建设项目（1988年）

通讯作者：吴权龙，E-mail：1697799138@qq.com；彭清华，E-mail：pqh410007@126.com

plasma group, and PDGF (10 μg/L) + 20% drug plasma group, and corresponding factors were added into each group for intervening for 48 hours. Transwell flow cytometry was used to detect cell cycle changes in different groups. Western blot was used to detect cyclin D1 protein, pERK1/2 and ERK1/2 protein expressions in rabbit RPE cells. Results 10% and 20% concentration of plasma containing invigorating blood and dissipating masses Chinese medicine inhibited RPE cell cycle, cyclin D1 protein, pERK1/2 and ERK1/2 proteins, which were equivalent to AG1296 inhibitor (P>0.05). There was statistical significance compared with other groups (P<0.01). Conclusion Plasma containing invigorating blood and dissipating masses Chinese medicine may inhibit proliferation of rabbit RPE cells treated with PDGF by affecting ERK signaling pathway and regulation of cyclin.

Keywords: invigorating blood and dissipating masses Chinese medicine; drug plasma; retinal pigment epithelium cells; cell cycle; platelet-derived growth factor; cyclineD1; pERK1/2; ERK1/2

增殖性玻璃体视网膜病变（ proliferative vitreoretinopathy，PVR）是 1983年由美国视网膜专家协会提出用于描述孔源性视网膜脱离（rhegmatogenous retinal detachment，RRD）等疾病后玻璃体和或视网膜前后面特异细胞增殖形成可以收缩的细胞性膜，进而引起视网膜牵拉、脱离与固定的一种病变，是一种

常见的难治性致盲性眼病[1]。目前研究表明，PVR是

[2-3]以细胞介导为主的病理过程 。视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞作为最关键细胞，贯穿于 PVR 发生的所有过程。而血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）则是参与 PVR 形成的主要细胞因子。目前临床上 PVR西药治疗作用比较单一，且细胞毒性大，基因治疗技术目前尚未成熟，手术治疗存在难度、风险大且易复发。中医辨证论治，不良反应较小，能取得良好的疗

效[4]。活血散结方根据眼科水血同治的原则组成[5]，本实验观察其药物血浆对PDGF-BB干预下兔RPE细胞的细胞周期、cycling D1 蛋白、pERK1/2 及 ERK1/2蛋白表达的影响，探讨该方有效治疗 PVR 与细胞增殖相关的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物成年健康无眼疾青紫蓝兔8只，雌雄不限，体质量 1.5～2.0 kg，上海市松江区车墩实验动物良种场提供，动物许可证号 SXCK（沪）2012-0008。成年健康家兔 10只，雌雄不限，体质量 1.5～2.0 kg，湖南中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号 SCXK

（湘）2015-0004。饲养于室温 18～26 ℃、相对湿度约55%环境，保持空气流通，常规饲料喂养。实验前行常规眼科检查（裂隙灯、间接眼底镜），排除眼内外疾患后进入实验。实验前所有动物适应性饲养1周。

1.2 药物及制备

活血散结方（三七6 g、丹参 15 g、昆布 15 g 等）， 饮片由湖南中医药大第一附属医院药剂科提供，水煎

2次，将药液混合浓缩至含 1.025 g 原药材/mL，4 ℃保存。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM/F12（美国 Hyclone），胎牛血清（杭州四季青），流式细胞周期检测试剂盒（南京凯基）， PDGF-BB（美国 Sigma），AG1296（美国 Selleck）， RIPA组织细胞快速裂解液（碧云天），BCA蛋白定量

试剂盒（碧云天），30%丙烯酰胺（Solarbio），Tris （Solarbio），HCl（国药集团），SDS（美国 Sigma），过硫酸铵（ Solarbio ）， TEMED （国药集团）， 5X SDS-PAGE loading buffe（r Vazyme），蛋白预染 Marker （ Fermentas ）， PVDF 膜（ Millipore ），脱脂奶粉

（Solarbio），PBS（博士德），Tween-20（Amresco）， ECL 发光液（美国 Thermo），PDGF-BB（美国 Sigma）， HRP 羊抗鼠二抗（Proteintech），cyclin D1 小鼠单克隆抗体（ Abcam ）， GAPDH 小鼠单克隆抗体

（Proteintech），ERK1/2 小鼠单克隆抗体（Abcam），

pERK1/2 小鼠单克隆抗体（Abcam），GAPDH 小鼠单克隆抗体（ Proteintech ）， HRP 羊抗鼠二抗

（Proteintech）。CO2细胞培养箱（美国 Thermo）、生物安全柜（美国 Thermo），倒置显微镜（德国 Motic），低速离心机（美国 Thermo），MDF-382E 型超低温冰箱（日本Sanyo），压力蒸汽灭菌器（上海亚明热处理设备公司），荧光显微镜（德国 Zeiss），低速离心机（美国 Thermo），MDF-382E 型超低温冰箱（日本Sanyo），单通道移液器（德国 Eppendorf），八通道电动移液器（德国 Eppendorf），酶标仪（美国 Bio-tek，

ELX800）。2 实验方法

2.1 药物血浆制备

成年健康家兔 10 只，随机分为空白组和活血散结方组。根据人与家兔体表面积换算方法计算（人以

60 kg体质量为标准，家兔以1.6 kg体质量为标准）活血散结方家兔临床等效剂量为5.064 g/（kg•d）。取

4倍家兔临床等效剂量为每日20.256 g/kg≈20.5 g/kg，水煎制成浓度为1.025 g原药材/mL活血散结方药液。活血散结方组每日 20 mL/kg 灌胃 2 次，空白组灌服等量蒸馏水，连续5d。第 5日灌胃2 h后麻醉腹主动

脉取血，3000 r/min 离心 10 min，收集上清液即为药

物血浆。0.22 μm过滤器分装，置于-70 ℃冰箱保存。

2.2 原代兔视网膜色素上皮细胞的培养及鉴定利用青紫蓝兔为实验对象，按酶消化法获取RPE

细胞原代细胞。5 mL 注射器于青紫蓝兔耳缘静脉处空气栓塞法处死，无菌条件下取出眼球，去除表面筋膜，生理盐水洗净，浸泡于4 ℃、400 U/mL 庆大霉素生理盐水。PBS冲洗 3次后去除角膜、晶状体以及玻璃体。D-Hanks 液中漂洗 2 次，滴加 0.25%胰酶，室温下静置10 min，由视网膜周边至视乳头方向轻轻去除视网膜神经上皮层后PBS 冲洗 3 次。滴加 0.25%胰蛋白酶 0.2 mL，置于细菌培养箱中消化30 min，加入含 10%胎牛血清的培养基终止反应。获取细胞悬

液，800 r/min 离心 10 min，弃上清液。在离心管再次胰酶消化、吹打，加入10%胎牛血清的培养基，终止反应，离心，弃去上清液，加入10%胎牛培养基将细胞吹打分散，将RPE 细胞调整为（4～5）×104个/mL的密度，并接种于 25 mL 培养瓶，在含 5%CO2、湿度为 90%的 37 ℃培养箱中培养。细胞贴壁后每 3 d更换培养液，直到细胞融合。当细胞贴壁铺满大部分瓶底即可进行传代培养。取原代生长RPE 细胞，PBS洗涤 2次，胰酶消化，细胞脱壁分散后即加少量完全

培养基终止消化。1000 r/min 离心 4 min，弃上清液，加 1～2 mL 完全培养液后吹匀，按（4～5）×104个/mL的细胞密度传代培养。取对数生长期第2代细胞，用

Cytokeratin-8 特异性抗体免疫荧光法[6]在荧光显微镜下进行观察鉴定。

2.3 活血散结方药物血浆干预视网膜色素上皮细胞增殖测定

选取第 4 代体外培养兔 RPE 细胞，分为空白对照组（DMEM），正常血浆组（正常血浆）及 5%、10%、

20%、40%、60%、80%、100%药物血浆组（取血浆样本，按体积比1∶2加入纯甲醇，涡旋混合10 min，

12 000 r/min 离心 10 min，取上清液，40 ℃氮气吹干，成冻干粉。用培养基溶分别溶解成7个浓度药物血浆。

96孔板培养板培养，每组各设5个复孔。采用 CCK-8法检测兔 RPE细胞活力。取对数生长期兔RPE 细胞，用培养基配成细胞悬液并调整细胞密度至50 个/μL，

每孔（96 孔板培养板）加入 100 μL，铺板后用 PBS

填充边缘孔。置于培养箱，5%CO2、37 ℃孵育，待细胞单层铺满孔底，加入用无血清培养基配制的不同浓度的药物血浆，每孔总体积为200 μL。培养 48 h后，每孔加 10 μL 7sea-cell counting kit。继续培养 2 h 后，应用酶标仪检测 450 nm 处的吸光度（OD）。记录结果，绘制图表，计算各组细胞增殖抑制率和IC50。细

胞增殖抑制率（%）＝[1－（实验组 OD 值÷正常血浆组OD 值）]×100%。

2.4 血小板源性生长因子干预视网膜色素上皮细胞细胞增殖测定

选取第 4 代体外培养兔 RPE 细胞，实验分为空白对照组（DMEM）和 PDGF 低（5 μg/L PDGF-BB）、

中（10 μg/L PDGF-BB）、高（20 μg/L PDGF-BB）剂

量组。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板加 100 μL/孔，铺板，使待测细胞密度至 5000 个细胞/孔，边缘孔用 PBS 填充。设 5 个复孔/样本/浓度，

5%CO2、37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底，加入用无

血清培养基配制的不同浓度梯度的药物，5%CO2、

37 ℃培养 48 h。每孔加 10 μL 试剂盒中 7sea-cell counting kit溶液，同步设调零孔。继续培养2h，于酶标仪 450 nm处测定OD。

2.5 活血散结方药物血浆和血小板源性生长因子干预兔视网膜色素上皮细胞增殖测定

实验细胞选取第 4 代体外培养兔 RPE 细胞，分为空白对照组（DMEM）、正常血浆组（正常血浆）、PDGF 组（10 μg/L PDGF-BB）、PDGF＋AG1296 组

（10 μg/L PDGF-BB＋10 μmol/L AG1296）、PDGF＋

10%药物血浆组（10 μg/L PDGF-BB＋10%活血散结药

物血浆）、PDGF＋20%药物血浆组（10 μg/L PDGF-BB

20%活血散结药物血浆）。

2.6 流式细胞仪检测兔视网膜色素上皮细胞周期胰酶消化并收集对数生长期的 RPE 细胞，调整细胞悬液密度至 5×105个/mL，取 6 孔板，根据“2.5”项下分组情况每个孔板加入相应细胞1 mL/孔上述细胞悬液，补足 2 mL 完全培养基，轻轻混匀，置于

5%CO2、37 ℃培养箱中培养，至每孔内细胞融合率达70%～80%，根据分组加入相应干预因素，48 h 后收样，流式细胞仪检测细胞周期。步骤：离心收集细胞，弃上清，用预冷 PBS 冲洗细胞 2 次；加入预冷

70%乙醇，于 4 ℃固定过夜；离心收集细胞，1 mL PBS冲洗细胞1次，加 450 μL PBS 重悬细胞，加 50 μL

RnaseA（2.5 mg/mL），使 RNase A 终浓度为250 μg/mL，

4 ℃避光孵育30 min；取 50 μL 碘化丙锭（1 mg/mL），

加入上述细胞悬液中，使PI终浓度为100 μg/mL，4 ℃避光孵育 30 min。1 h内进行流式细胞仪检测。

2.7 Western blot检测兔视网膜色素上皮细胞cyclin D1、

pERK1/2 及 ERK1/2 蛋白表达用胰酶消化液消化并收集对数生长期的 RPE 细胞；调整细胞悬液密度至5×105个/mL；取 6孔板，

根据“2.5”项下分组情况加入相应细胞1 mL/孔上述细胞悬液，补足2 mL完全培养基，轻轻混匀；置于

5%CO2、37 ℃培养箱中培养；至每孔内细胞融合率达70%～80%，根据分组加入相应干预因素；48 h 后收样，进行 Western blot检测。将需要抽提的蛋白细胞样本加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解

液，4 ℃充分裂解，将其刮入1.5 mL EP 管中，95 ℃以上加热 10 min，12 000×g 离心 10 min，取上清液，

进行蛋白质定量后置于-80 ℃冰箱保存。取等量蛋白进行电泳、转膜、封闭。根据说明书稀释一抗，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜室温孵育2 h或

4 ℃孵育过夜。孵育一抗膜用TBST洗涤3次×5 min，随后根据用量，按 1∶2000 稀释 HRP 标记的二抗，与膜 37 ℃孵育1h。用 TBST 洗涤 3 次×5 min。最后用 ECL 化学发光检测，将胶片进行扫描，用图像分析软件 IPP6.0 对图像进行灰度分析。3 统计学方法

采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s — 表示，采用方差分析，组间两两比较用LSD 法（方差齐）或 Tamhane 法（方差不齐）。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

4 结果4.1 兔视网膜色素上皮细胞生长状况及鉴定倒置显微镜下观察，采用酶消化法取材，RPE原代细胞呈圆形，胞体透亮，胞浆内可见较多黑色素颗粒，可见清晰透明的单核细胞或双核细胞。接种24 h后，细胞开始贴壁伸出伪足，逐渐变成扁平不规则多

角形，分裂繁殖增快，生长活跃。5～7 d细胞基本融合呈镶嵌状排列。传代细胞1 h 开始贴壁，24 h大部分贴壁伸出伪足，胞浆内黑色素颜色和颗粒随着传代次数的增加而减少，传至第4代时明显减少。传至第

6 代时，胞体透亮肥大，胞浆内色素完全消失，细胞

轮廓清楚，细胞核及核仁清晰可见。Cytokeratin-8 特异性抗体免疫荧光法结果显示，荧光显微镜下观察RPE细胞，荧光遍及胞质，细胞角蛋白染色呈强阳性。

4.2 活血散结方药物血浆对兔视网膜色素上皮细胞增殖和毒性的影响

活血散结方药物血浆各组干预RPE 细胞 48 h 后 细胞增殖与毒性检测结果显示，药物血浆对 RPE 细胞均有不同程度的增殖抑制作用，且存在一定量效关系（正相关），其中5%～20%活血散结方药物血浆对细胞有较弱的抑制作用，与正常血浆组比较，细胞活力 OD 值差异无统计学意义（P＞0.05），而 4%～100%活血散结方药物血浆对细胞的抑制作用则更为明显，与正常血浆组比较，细胞活力OD值差异有统计学意

义（P＜0.05）；20%以下药物血浆对 RPE细胞的增殖抑制率低于1.92%，计算活血散结方药物血浆 IC50 为

95.65%，表明此次制备的活血散结方药物血浆虽然对RPE细胞有一定的增殖抑制作用，但毒性较低，20%及以下浓度活血散结方药物血浆对 RPE 细胞无明显细胞毒性。综合以上结果考虑选取10%、20%活血散结方药物血浆作为下一步实验干预浓度。结果见表1。

4.3 血小板源性生长因子对兔视网膜色素上皮细胞增殖的影响

不同剂量 PDGF 对 RPE 细胞的细胞活力均有一定的增强作用，且存在一定的量效关系，与空白对照组比较，细胞活力 OD 值差异有统计学意义（P＜

0.01）；其中 PDGF中、高剂量组较PDGF低剂量组作用更强，细胞活力 OD 值差异均有统计学意义（P＜

0.05）；而 PDGF 中剂量组与 PDGF 高剂量组作用相当，细胞活力OD 值差异无统计学意义（P＞0.05）。故选取 10 μg/L PDGF-BB作为下一步实验干预浓度。结果见表2。

4.4 活血散结方药物血浆对血小板源性生长因子干预下视网膜色素上皮细胞周期的影响

PDGF 对 RPE 细胞周期有明显影响作用，PDGF组 S＋G2期比例高于正常血浆组，差异有统计学意义

（P＜0.01），表明PDGF有促进RPE细胞增殖的作用；

AG1296 对 RPE 细胞周期有明显影响作用，PDGF＋

AG1296 组 S＋G2期比例低于 PDGF 组，差异有统计

学意义（P＜0.01），表明 AG1296 具有抑制 RPE 细胞增殖的作用，能阻止PDGF 促 RPE细胞增殖；而10%、

20%活血散结方药物血浆亦能明显影响 RPE 细胞周

期，2个浓度活血散结药物血浆组S＋G2期比例均低于 PDGF 组，差异均有统计学意义（P＜0.01），表明

2个浓度活血散结方药物血浆均有抑制RPE细胞增殖的作用，能阻止PDGF促RPE细胞增殖，均与AG1296

抑制剂作用相当，差异均无统计学意义（P＞0.05），且10%、20%活血散结方药物血浆作用相当，差异无

统计学意义（P＞0.05）。结果见表 3。

—

4.5 活血散结方药物血浆对视网膜色素上皮细胞cyclin D1蛋白表达的影响

PDGF 有促进 RPE 细胞 cyclin D1蛋白表达的作，与正常血浆组比较，PDGF组 RPE 细胞 cyclin D1

白表达差异有统计学意义（P＜0.01）；AG1296 有制 RPE 细胞 cyclin D1 蛋白表达的作用，PDGF＋

AG1296 组 RPE 细胞 cyclin D1 蛋白表达低于 PDGF

，差异有统计学意义（P＜0.01），表明 AG1296 具阻止PDGF促RPE细胞cyclin D1蛋白表达的作用；

10%、20%活血散结方药物血浆均可抑制 RPE 细胞cyclin D1 蛋白表达，2个浓度活血散结方药物血浆组RPE 细胞 cyclin D1蛋白表达均低于PDGF 组，差异

均有统计学意义（P＜0.01），表明 2个浓度活血散结方药物血浆均具有阻止PDGF 促 RPE 细胞 cyclin D1蛋白表达的作用，与 AG1296 抑制剂作用均相当，差

异均无统计学意义（P＞0.05），且 2个浓度活血散结

方药物血浆组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表4、图 1。

4.6 活血散结方药物血浆对视网膜色素上皮细胞

ERK信号通路蛋白表达的影响

PDGF 有促进 RPE 细胞 pERK1/2、ERK1/2 蛋白表达的作用，与正常血浆组比较，PDGF组 RPE 细胞pERK1/2、ERK1/2 蛋白表达差异有统计学意义（P＜ 0.01）；AG1296 有抑制 RPE 细胞 pERK1/2、ERK1/2蛋白表达的作用， PDGF ＋ AG1296 组 RPE 细胞

pERK1/2、ERK1/2 蛋白表达低于 PDGF 组，差异有

统计学意义（P＜0.01），表明 AG1296 具有阻止 PDGF促 RPE 细胞 pERK1/2、ERK1/2 蛋白表达的作用；而

10%、20%活血散结方药物血浆均可抑制 RPE 细胞

pERK1/2、ERK1/2 蛋白表达，2 个浓度药物血浆组RPE 细胞 pERK1/2、ERK1/2 蛋白表达均低于 PDGF

组，差异均有统计学意义（P＜0.01），表明2个浓度活血散结方药物血浆具有阻止 PDGF 促 RPE 细胞

pERK1/2、ERK1/2 蛋白表达的作用，但与 AG1296

抑制剂作用相当，差异无统计学意义（P＞0.05），且

2 个浓度活血散结方药物血浆组组间比较差异无统计

学意义（P＞0.05）。结果见表 5、图 2。

—

5 讨论中医对视网膜增殖物的辨证，认为凡出血所致日久不散变成膜状物多属气血瘀滞，炎症所致的增殖多因痰湿凝结。活血散结方中三七化瘀止血活血，丹参活血祛瘀，入肝经血分，二药合用活血化瘀，共为君药；昆布消痰软坚、利水消肿，入肝肾两经。全方共奏活血化瘀、软坚散结之功，使眼内瘀血痰结之有形之物消散，改善眼底情况，提高患者视功能。陈吉

等[7-8]研究表明，活血利水法能降低 PVR 增殖膜中转

化生长因子-β1、纤维连接蛋白信使核糖核酸阳性表达，抑制 PVR 的发生发展。付美林等[9-10]研究也显示，活血利水法可通过拮抗增殖膜中整合素 β1、EGF mRNA表达的作用来抑制增殖细胞的过度增生，从而防治 PVR形成和发展。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族是真核细胞内普遍存在的参与调节细胞生物学反应的重要信号系统，与细胞的增殖、分化、转化及凋亡等不同调节功能密切相关。Ras/Raf/MEK/ERK 是其中重要的信号通路，而 ERKl/2 是这一信号通路下游的核心元件。Punn 等[11]发现 ERKl/2信号传导通路的激活可促进各种细胞增殖分裂、分化相关的转录因子合成，对细胞损伤修复意义重大。但病理情况下，由细胞外刺激调节的 RPE 细胞 ERKl/2 信号传导通路激活并扩大，则有 RPE 细胞增殖、分化过度的可能，导致视网膜前或视网膜下的 RPE 细胞过量增殖，分化转型，终至PVR 增殖膜的形成。PDGF 可通过与 RPE 细胞细胞膜上的 PDGF受体结合，激活相应络氨酸蛋白激酶通路，引发 RPE 细胞内信号转导级联放大反应，促进RPE 增殖、迁移及凋亡。司艳芳等[12]通过体外细胞实验研究发现，PDGF-BB 诱导的人 RPE细胞的生物学活动主要通过 ERKl/2、p38 和 PI3K 等细胞信号转导

通路完成，ERKl/2 主要与人 RPE 细胞的增殖相关，而 p38 和 PI3K 主要与 RPE细胞的迁移相关。

Motkura 等[13]于 1991 年发现了 cyclin D1 基因，其编码翻译后的 cyclin D1 蛋白对细胞周期起着正性调节作用。研究发现，cyclin D1在细胞生长周期G1 期向S期转化方面发挥着重要作用[14]。有研究表明， cyclin D1表达过度可导致细胞分裂增殖明显提高，甚

至有恶变可能[15]。已有多项研究证实，cyclin D1 的表达减少会阻滞细胞周期G1 期向 S 期的转化[16-20]。郭

丽莉等[21]通过细胞实验也发现，RPE细胞中 cyclin D1的表达减少同样会阻滞细胞周期G1期向S期的转化。

本实验研究结果显示，10%、20%活血散结方药物血浆均能降低 PDGF 干预下兔 RPE 细胞 S＋G2 期的比例，且存在一定的量效关系趋势，与PDGF 组比

较差异均有统计学意义（P＜0.01），表明 10%、20%活血散结方药物血浆均有抑制 PDGF 干预下兔 RPE细胞的增殖、迁移的作用，抑制PDGF 干预下兔 RPE

细胞进入分裂增殖周期。2 个浓度药物血浆以上作用均与 AG1296 相当（P＞0.05），但 10%和 20%活血散

结方药物血浆以上作用亦相当（P＞0.05）。研究结果

还显示，10%、20%活血散结方药物血浆均能抑制PDGF干预下兔RPE细胞与细胞增殖相关的细胞周期调控蛋白 cyclin D1 及 ERK1/2 细胞信号通路

pERK1/2、ERK1/2 蛋白的表达，且存在一定的量效关系趋势，与 PDGF 组比较差异均有统计学意义（P＜

0.01），均与 AG1296 作用相当（P＞0.05），10%、20%

活血散结方药物血浆以上作用亦相当（P＞0.05）。表明 10%、20%活血散结方药物血浆均能通过抑制cyclin D1 蛋白的表达及抑制 ERK1/2 细胞信号通路

pERK1/2、ERK1/2 蛋白的表达而阻止 RPE 细胞分裂增殖。

综上，活血散结方药物血浆能有效抑制 RPE 细胞增殖，其机制是通过抑制 ERK 信号通路，以及对周期蛋白的调控来抑制RPE细胞增生。

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（收稿日期：2018-08-23）

（修回日期：2018-09-27；编辑：华强）