加味脑泰方对大鼠缺氧/复氧损伤海马神经元炎性通路SIRT1/NF-κB 的影响

易亚乔，刘检，刘林，成绍武，廖君，王国佐，谭琥，刘吉勇，陈俊炜，王玮，郭艳幸，葛金文(45)

易亚乔1，刘检 2，刘林2，成绍武1，廖君3，王国佐1，谭琥1，刘吉勇1，陈俊炜 1，

王玮1，郭艳幸4，葛金文 3

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；

3.湖南中医药大学湖南省中西医结合基础重点学科，湖南 长沙 410208；

4.河南省洛阳正骨医院，河南 洛阳 471002

摘要：目的 观察加味脑泰方对大鼠缺氧/复氧损伤海马神经元炎性通路 SIRT1/NF-κB 的影响，初步探讨其作用机制。方法 原代分离、培养及鉴定SD大鼠胎鼠海马神经元，采用缺氧24 h、复氧 2h干预构建缺氧/复氧细胞模型。将培养的原代海马神经元随机分为正常组、空白血清对照组、模型组、阳性药药物血清组和加味脑泰方药物血清组，待缺氧24 h后，除正常组和模型组给予等量培养液外，其余各组分别给予相应体积分数10%药物血清或空白血清，继续复氧共孵育培养2 h；采用 MTT法检测海马神经元细胞活力，高内涵细胞成像分析系统检测海马神经元沉默信息调节蛋白1（SIRT1）、核因子-κB 抑制蛋白（IκBα）、核因子-κB（NF-κB）蛋白表达。结果 与正常组比较，模型组海马神经元细胞活力显著降低（P＜0.01），神经网络及树突、树突棘断裂或减少，细胞明显受损，且神经元内 SIRT1、IκBα 蛋白表达显著降低（P＜0.05），NF-κB 蛋白表达明显

增加（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药药物血清组和加味脑泰方药物血清组海马神经元细胞活力明显增加

（P＜0.05），神经网络、树突棘受损明显改善，且神经元内 SIRT1、IκBα 蛋白表达明显上调（P＜0.05），NF-κB

蛋白表达明显下调（P＜0.05）。结论 加味脑泰方对缺氧/复氧损伤海马神经元内炎性相关信号通路 SIRT1/ NF-κB具有明显的调控作用，这可能是其保护缺氧/复氧损伤海马神经元继而抗血管性痴呆的重要机制之一。

关键词：加味脑泰方；海马神经元；缺氧/复氧；沉默信息调节蛋白1；核因子-κB 抑制蛋白；核因子-κB；血管性痴呆；大鼠

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)03-0045-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.03.011 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

基金项目：国家自然科学基金（81603604、81774174）；中国博士后科学基金面上项目（2018M632972）；湖南省中医药科研

项目（201822）；湖南省教育厅课题（09k056）；湖南中医药大学大学生研究性学习和创新性实验计划项目（201705）

通讯作者：葛金文，E-mail：40831556@qq.com

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由于缺血性、出血性卒中或造成记忆、认知和行为等脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合

征[1]。VD 发病率逐年增加，不但严重影响患者生活质量，同时也带来沉重的医疗负担，目前临床尚无治疗 VD的特效药物，主要从改善脑微循环、认知功能

障碍、神经递质紊乱及保护脑细胞等方面着手[2-3]。VD 发病机制目前尚未完全阐明，研究发现沉默信息调节蛋白 1（silent information regulator 1，SIRT1）是细胞内信号转导网络的关键靶点，在调控血管性认知功能障碍及细胞衰老、凋亡等方面均发挥着重要作

用[4]，另外，SIRT1 mRNA在海马神经元中高度表达，其能通过抗炎效应减轻缺血性脑损伤，而炎症反应在VD 等慢性脑缺血继发性神经损伤中起主要作用。因

此，SIRT1 可能是抗VD的潜在靶点。加味脑泰方源自《医林改错》补阳还五汤，并结合临床治疗VD用药经验加减而成，由黄芪、当归、川芎、地龙、石菖蒲、三七、远志组成。本课题组前期研究发现，加味脑泰方能明显改善VD大鼠学习记忆能力，并抑制炎症相关因子核因子-κB（NF-κB）的

[5-6]

表达 。本研究采用原代海马神经元缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）体外细胞模拟缺血再灌注VD模型，观察加味脑泰方对H/R损伤海马神经元保护作用，并从 SIRT1炎性通路初步探讨其机制。1 实验材料

1.1 动物

SD雌性大鼠5 只，SPF级，受孕 18 d；SD 雄性大鼠 9 只，SPF级，体质量 180～220 g，均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK

（湘）2013-0004。饲养于温度（25±1）℃、相对湿

度（55±5）%环境，12 h光照，自由摄食饮水。

1.2 药物加味脑泰方（黄芪、川芎、地龙、当归、石菖蒲、三七、远志），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院中药房，水煎制成浸膏粉（湖南中医药大学药学院制剂教研室提取）；奥拉西坦注射液，广东世信药业有限公司，批号 1610002。本实验中加味脑泰方和奥拉西坦给药剂量分别为12 g/kg 和 0.36 g/kg。

1.3 主要试剂与仪器

Neurobasal medium、B27 Supplement（Gibco 公

司），DMEM/F12、FBS（Hyclone 公司），兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶（NSE）多克隆抗体（武汉博士德生物工程科技公司），兔抗大鼠 SIRT1、IκBα、NF-κB 多克隆抗体（Proteintech 公司），小鼠抗大鼠β-tublin 和 β-actin 抗体、FITC 标记羊抗兔 IgG、R-PE标记羊抗小鼠IgG及DAP（I Abcam公司）。SW-CJ-2FD

型超净工作台（苏州智净净化设备有限公司），S8PAO型体视显微镜（德国 Leica 公司）、CO48R-230 型细胞培养箱（New Brunswick Galaxy 公司），OPERETTA型高内涵细胞成像分析系统（HCA，美国 PerkinElmer公司）。

2 实验方法

2.1 药物血清制备

取 SD雄性大鼠9只，按体质量随机分为空白血

清对照组、阳性药药物血清组、受试药药物血清组，分别给予等量蒸馏水、临床等效剂量奥拉西坦和加味脑泰方浸膏粉灌胃，每日2次，连续3d，末次给药

1 h，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，3000 r/min离心15 min，收集血清，56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm

微孔滤膜过滤后，分装至-80 ℃冰箱保存备用。

2.2 海马神经元原代培养与鉴定

取孕 18 d SD大鼠，10%水合氯醛麻醉后迅速取全脑置于体视显微镜下，分离海马，加入等体积胰蛋

白酶和胶原酶，37 ℃消化 15 min，终止消化，收集

上清液，1000 r/min 离心 5 min，弃上清液，重悬，200目筛网过筛，调整细胞密度为3×105个/mL，接种至

预先左旋多聚赖氨酸包被的细胞培养板中，4～6 h 后

全量换成无血清培养基（98%Neurobasal、1%B27、

1% L-谷氨酰胺），之后每3d半量换液1次。待神经元生长至5～7d，弃掉孔内液体，冷 0.01 mol/L PBS润洗 3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.25%Triton-100作用 15 min，5%BSA 封闭 30 min，加入兔抗大鼠 NSE和小鼠抗大鼠 β-tublin 一抗稀释液（体积比1 ∶100），

4 ℃湿盒避光孵育过夜。次日弃液，冷0.01 mol/L PBS润洗 5 次，加入 FITC 标记的山羊抗兔和 RP-E 标记的山羊抗小鼠二抗稀释液（体积比1 ∶200），37 ℃避光孵育 30 min，弃液，冷 0.01 mol/L PBS 润洗 5 次，加入 DAPI稀释液，室温避光孵育20 min，弃液，冷

0.01 mol/L PBS 润洗 3次，最后每孔加入50 μL PBS，于 HCA上观察并拍照。

2.3 造模、分组及给药

取生长7d成熟海马神经元，随机分为正常组、空白血清对照组、模型组、阳性药药物血清组、加味

脑泰方药物血清组，参照文献[7]方法，建立 H/R 细胞模型。将细胞培养液换成无糖 DMEM 培养基，同时置入三气细胞培养箱中，持续通入混合气体

（95%N2＋5%CO2），流速保持在 0.5 L/min，缺氧 24 h后，模型组重新换成无血清培养液继续培养，其余组全量换液相应含10%空白血清、奥拉西坦药物血清及加味脑泰方药物血清的无血清培养基，再将各组放回细胞培养箱中持续复氧 2 h。正常组则用无血清培养基正常培养26 h，不做任何处理。

2.4 MTT法检测海马神经元活力将海马神经元接种至 96 孔板中，待细胞生长至

5～7d，随机分为正常组、空白血清对照组、模型组、阳性药药物血清组和加味脑泰方药物血清组，除正常组外，其余各组分别进行缺氧24 h、复氧 2 h处理，每组设3个复孔，造模后，每孔加入20 μL MTT，37 ℃孵育 4 h，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，于水平摇床上震摇15 min，于酶标仪 492 nm波长处测定吸光度（OD），并计算细胞活力。细胞活力（%）＝实验组OD值÷正常组OD 值×100%。

2.5 HCA检测沉默信息调节蛋白1、核因子-κB 抑制蛋白、核因子-κB蛋白表达

将海马神经元接种至 96 孔板中，待细胞生长至

5～7 d，随机分为正常组、空白血清对照组、模型组、阳性药药物血清组和加味脑泰方药物血清组，上述各组细胞进行缺氧24 h、复氧 2h后，弃掉孔内液体，冷0.01 mol/L PBS润洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，

0.25%Triton-100 作用15 min，5%BSA 封闭30 min 后，加入小鼠抗大鼠 β-actin 和兔抗大鼠 SIRT1、IκBα 或NF-κB 一抗稀释液（体积比1 ∶100），4 ℃避光孵育过夜，弃液，冷 0.01 mol/L PBS 润洗 5次，加入 FITC标记的山羊抗兔和 RP-E 标记的山羊抗小鼠二抗稀释液（体积比1 ∶200），37 ℃避光孵育30 min，弃液，冷 0.01 mol/L PBS 润洗 5次，加入 DAPI 稀释液，室温避光孵育20 min，弃液，冷 0.01 mol/L PBS 润洗

3次，最后每孔加入50 μL PBS，于 HCA上进行荧光检测并拍照，随机选取6个视野，先找到DAPI 标记的细胞核，再找到 β-actin 标记的细胞骨架，计算DAPI与 β-actin 融合区域（即目标细胞）阳性表达蛋白的荧光强度值，最后通过分析得到每个细胞的平均荧光强度值（即相对荧光强度值）。

3 统计学方法

采用 SPSS16.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s — 表示，组间差异采用方差分析，方差齐用LSD 检验，方差不齐用 Dunnett's T3 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

4 结果4.1 海马神经元形态学特点及免疫荧光鉴定在倒置光学显微镜下观察，海马神经元之间可见突触连接，胞体明显、突起纵横交错，并相互交织成丰富的神经网络。经免疫细胞化学染色及HCA检测， NSE 标记阳性者呈绿色荧光，在神经元骨架被β-tublin 标记后，可见绿色荧光在胞浆中均呈阳性表达，提示所得细胞为目标细胞（即海马神经元）。结果见图1。

4.2 加味脑泰方对海马神经元细胞活力的影响与正常组比较，模型组海马神经元细胞活力均明显降低，提示造模成功；与模型组比较，阳性药药物血清组和加味脑泰方药物血清组细胞活力显著增加，

差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见图2。

—

4.3 加味脑泰方对缺氧/复氧损伤海马神经元沉默信息调节蛋白 1、核因子-κB 抑制蛋白、核因子-κB蛋白表达的影响

经 HCA检测，蓝色荧光为DAPI标记的细胞核，橙黄色荧光为 RP-E 标记的细胞骨架 β-actin，绿色荧光为 FITC 标记的炎性相关阳性表达蛋白 SIRT1、NF-κB或IκBα，HCA随机选取6个视野，先找到DAPI标记的细胞核（即总细胞数），再找到 β-actin 标记的细胞骨架（即表达区域），计算 DAPI 与 β-actin 融合区域内 FITC 标记的阳性表达蛋白（即蛋白相对表达量），进而分析得到每个细胞的平均荧光强度值（即相对荧光强度值）。经H/R 干预造模后，HCA检测结果显示，与正常组比较，模型组及空白血清对照组海马神经元 SIRT1、IκBα 蛋白平均荧光强度值明显降低，NF-κB蛋白平均荧光强度值明显增加，差异均有

统计学意义（P＜0.05），且神经网络及树突、树突棘断裂或减少，细胞明显受损；与模型组比较，阳性药药物血清组和加味脑泰方药物血清组海马神经元

SIRT1、IκBα 蛋白平均荧光强度值明显增加，NF-κB蛋白平均荧光强度值明显降低，差异均有统计学意义

（P＜0.05），神经网络、树突棘受损情况得到明显恢复，而荧光强度与蛋白表达水平呈正相关，提示加味脑泰方对 H/R 损伤海马神经元内炎性相关蛋白SIRT1、NF-κB 和 IκBα具有明显的调控作用，其可能是保护 H/R 损伤海马神经元的重要机制之一。见图3～图 8。

5 讨论

VD 是以认知、记忆等诸多功能缺损为主，并且可能伴有语言、人格或情感障碍的一种获得性智能持续性损害疾病，而脑血管病变导致局部或全脑缺血、缺氧，继而引起脑部与认知、记忆等相关的特定神经组织损害是VD发病的主要病理过程，因而慢性脑缺血成为研究VD发病机理的重要组成部分。相关动物

实验研究表明，双侧颈总动脉永久性结扎术（2-VO法）能持续造成慢性脑低灌注状态，从而使脑组织特别是易损区域（如海马、皮层等）产生缺血缺氧性损伤，导致渐进性 VD 发生[8]。本研究采用原代海马神经元 H/R 体外细胞模型，结果显示 H/R 干预造模后海马神经元细胞存活率显著降低，神经网络及树突、树突棘断裂或减少，细胞明显受损，很好模拟了体内VD 发病脑缺血供氧不足的海马神经元损伤过程，提示造模成功。

长寿蛋白（silent mating type information regulation 2 homolog，Sirtuin）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的一种去乙酰化酶，与酵母沉默调控因子 2 （ silent information regulator 2，Sir2）蛋白同源，由SIRT1～7组成，其中 SIRT1 与 Sir2 同源性最高。研究发现，

SIRT1介导的信号通路与学习记忆、认知功能的改善

密切相关，SIRT1 mRNA在海马神经元具有丰富的表达，敲除小鼠 SIRT1后，突触可塑性明显受损，学习

记忆、认知能力下降[9]。此外，SIRT1/NF-κB 信号通路介导了 VD 病理机制的炎症过程，慢性缺血缺氧VD 发生时，NF-κB 作为脑缺血后反应最早的炎症因

子，SIRT1 可促使其下游因子 NF-κB 亚单位 RelA/p65去乙酰化，进而抑制其转录活性，同时抑制 IκBα 磷酸化，减少炎症因子和趋化因子的产生，防止炎症引

[10-11]

起的神经元损伤 。本实验结果表明，与正常组比较，经 H/R干预造模后，海马神经元内 SIRT1、IκBα蛋白水平显著降低，NF-κB蛋白水平显著增加，且细胞明显受损，而给予加味脑泰方药物血清干预后，

SIRT1、NF-κB 和 IκBα蛋白表达异常被明显逆转，这提示加味脑泰方可能是通过调控 SIRT1/NF-κB 信号通路进而保护H/R损伤海马神经元。

VD好发于中风之后，属中医学“呆证”“善忘”

等范畴[12]，病机特点为本虚标实，病位在脑，五脏气血亏虚为本，痰瘀阻络为标，虚、瘀、痰是其重要的病因病机。加味脑泰方以黄芪为君，当归为臣，川芎、地龙等为佐药，具有益气活血、化痰祛瘀之功效。现代药理研究发现，当归小分子多糖、三七皂苷 R1 等具有显著抗炎、抗氧化、改善脑缺血和促进VD大鼠

的学习记忆功能[13]。本课题组前期研究发现，脑泰方通过抗血小板活化、抗血栓、抗炎等作用对缺血缺氧

脑组织起到明显的保护作用[14-15]。本实验结果亦再次佐证了其调控炎性通路进而保护 H/R 损伤海马神经元的作用，而脑缺血缺氧是VD的重要病因之一，因

此，我们推测加味脑泰方可能对VD有防治作用。

综上，加味脑泰方对H/R损伤海马神经元炎性通路 SIRT1/NF-κB 具有明显的调控作用，这可能是其保护 H/R损伤海马神经元继而抗VD的重要机制之一，后续实验我们将从基因水平，并辅以基因沉默技术，进一步阐明加味脑泰方对 H/R 损伤海马神经元的保护机制。

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（收稿日期：2018-06-20）

（修回日期：2018-07-20；编辑：华强）