电针对 SAMP8小鼠学习记忆与海马神经元NMDA 受体表达的影响

骆雍阳，蒋艺燕，杨文丹，赵恩聪，李斐斐，许茜，钱长晖，董卫国(51)

骆雍阳1，蒋艺燕2，杨文丹1，赵恩聪1，李斐斐1，许茜2，钱长晖2，董卫国 2

1.福建中医药大学针灸学院，福建 福州 350122；

2.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122

摘要：目的 观察电针“百会”“大椎”“肾俞”对SAMP8小鼠学习记忆与海马神经元NMDA受体 NR2A和 NR2B 表达的影响，探讨电针治疗阿尔茨海默病的机制。方法 6 月龄 SAMP8 小鼠 24 只，随机分为模型组和电针组，同龄正常老化 SAMR1 小鼠 12 只为对照组。电针组电针“百会”“大椎”“肾俞”30 d。Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力，免疫组化染色和 Western blot 检测海马神经元 NR2A 和 NR2B的表达。结果 与对照组比较，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长（P＜0.01)，原平台象限停留时间明显缩短（P＜0.01），

跨越原平台次数明显减少（P＜0.01），海马神经元NR2A 相对表达量明显升高（P＜0.01），NR2B 相对表达量

明显下降（P＜0.01）；与模型组比较，电针组小鼠逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05），原平台象限停留时间明显

延长（P＜0.01），跨越原平台次数明显增加（P＜0.05），海马神经元 NR2A 相对表达量明显下降（P＜0.05），

NR2B 相对表达量明显升高（P＜0.01）。结论 电针能改善 SAMP8 小鼠的学习记忆能力，其作用机制可能与电针抑制海马神经元NMDA 受体 NR2A的表达和促进NMDA 受体 NR2B的表达有关。关键词：阿尔茨海默病；电针；NMDA受体；SAMP8 小鼠

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)03-0051-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.03.012 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

基金项目：福建省自然科学基金（2017J01541）；福建省中医药科研项目计划（2017FJZYJC102）；福建省卫生计生中青年骨干

人才培养项目（2017-ZQN-63）；福建中医药大学校管课题（X2016016）

通讯作者：董卫国，E-mail：fjdwg601@163.com

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是以进行性认知功能障碍和记忆损害为主的中枢神经系统退行性疾病。其主要病理特征是细胞外β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积形成的老年斑、细胞内高度磷酸化 tau 蛋白形成的神经纤维缠结以及神经元和突触数量的减少。有研究报道，AD 早期可见突触功能障碍和突触丢失，提高突触可塑性能改善认知

[1-2]

功能障碍 。 N- 甲基 -D- 天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）是一种离子通道型谷氨酸受体，在突触可塑性的调控中起非常

重要的作用，参与学习和记忆的产生和维持过程[3] 。这与 NMDA 受体的功能单位 N-甲基-D-天冬氨酸受体 2A（N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2A，

NR2A ）亚基和 N-甲基 -D-天冬氨酸受体 2B （N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B，NR2B）亚基密切相关。我们前期研究表明，电针治疗能改善快速老化模型小鼠亚系 SAMP8 小鼠学习记忆能力和

突触功能[4-6]。SAMP8 小鼠目前被认为是一种较为完善的AD 模型[7] ，已广泛应用于AD 的研究[8]。本实验通过电针 SAMP8 小鼠“百会”“大椎”“肾俞”，观察电针对SAMP8小鼠海马神经元NMDA受体NR2A和 NR2B表达的影响，探讨电针改善SAMP8 小鼠学习记忆能力的可能机制，为电针防治AD的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

6月龄抗快速老化小鼠亚系SAMR1 小鼠 12 只，雄性，体质量 20～25 g，北京大学医学部实验动物中心提供，实验动物质量合格证号 SCXK （京）

2011-0012，设为对照组；6 月龄 SAMP8 小鼠 24 只，雄性，体质量 20～25 g，采用随机数字表法将其分为模型组和电针组，每组 12 只，北京维华阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物质量合格证号SCXK

（京）2014-0004。饲养于福建中医药大学 SPF 级动物实验中心，实验前小鼠适应性喂养1个月，实验动物均在完全一致的生活环境和饮食条件下饲养，温度

（23±1）℃，相对湿度（55±15）%，12 h 光照，自由摄食饮水。实验过程严格按国际动物保护及使用指南进行。

1.2 主要试剂与仪器

兔多克隆抗体NR2A（批号 ab203197），Abcam；兔多克隆抗体NR2B（批号 21920-1-AP），Proteintech； β-actin（批号 20536-1-AP），Proteintech；生物素标记的羊抗兔 IgG、DAB试剂盒，福州迈新生物工程有限公司；特超敏 ECL 化学发光试剂盒，碧云天生物技术公司；Motic Med 6.0 数码医学图像分析系统， Bio-Rad 图像分析系统。G6805-Ⅰ电针治疗仪，青岛

鑫升实业有限公司；0.25 mm×15 mm华佗牌无菌针灸针，苏州医疗用品厂有限公司；Morris水迷宫系统，中国医学科学院药物研究所；电镜CCD 相机-图像采集分析系统，德国 Soft-Imaging-System 公司。

1.3 干预电针组采用自制网兜固定小鼠，选择“百会”“大

椎”“肾俞”进行电针治疗，参照《实验针灸学》[9]取穴、定位：“百会”位于小鼠顶骨的正中，“大椎”位于背部正中（第7颈椎与第1胸椎间），“肾俞”位于第 2腰椎下两旁。具体操作方法：“百会”向前斜刺 2 mm，“大椎”向下斜刺2～3 mm，“肾俞”稍向内斜刺3～4 mm，其中“大椎”“肾俞”加电针，“肾俞”双侧交替进行。进针后不进行手法刺激，连接电针治疗仪，连续波，频率2 Hz，电流强度以引起小鼠后肢肌肉轻微颤动而不嘶叫为宜。每日1次，每次20 min，8d为 1 个疗程，疗程间隔 2 d，进行下 1 个疗程，共 3个疗程。模型组和对照组不进行电针治疗，只进行与电针组相同方式、时间和程度的抓取和固定。

1.4 Morris 水迷宫实验

采用 Morris 水迷宫实验检测小鼠空间学习记忆能力，包括有定位航行实验和空间探索实验。电针治疗结束后开始进行定位航行实验。将平台置于第三象限，没于水下1 cm，每日上、下午各训练4次，将小鼠分别从4个入水点（各象限池壁中点）面向桶壁放入水中，记录小鼠爬上平台所需时间，即逃避潜伏期，如果 90 s 内未找到平台则将其引至平台并在平台停留 10 s，记录逃避潜伏期为90 s，连续 5 d。第 6日撤

掉平台，进行空间探索试验，将小鼠从第一象限池壁中点放入池中，自由游泳90 s后结束试验，记录小鼠在原平台象限停留的时间和跨越原始次数。

1.5 免疫组化染色检测水迷宫实验测试结束后，每组取6 只小鼠，10%

水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上，剪开胸腔，暴露心脏，从心尖插入灌注针至左心室，同时剪开右心耳。快速注入 37 ℃生理盐水 80 mL，再注入4%多聚甲醛 80 mL灌流固定。取全脑修块后立刻放入4%多聚甲醛内，4 ℃固定24～

48 h。常规梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。石蜡切片，厚约4 μm，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，将黏附脑组织载玻片置于柠檬酸修复液中，微波炉加热修复，降至室温。分别加入NR2A 抗体和 NR2B 抗

体，4 ℃湿盒孵育过夜。37 ℃复温1 h后加入生物素标记的羊抗兔IgG 的二抗，DAB显色，脱水，透明，封片。用 PBS代替一抗作阴性对照。用 Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对海马CA1区NR2A及NR2B的图片进行分析，计算NR2A 及 NR2B的平均光密度（MOD）。

1.6 Western blot 检测

每组取6只小鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，灌注针插入左心室，快速注入37 ℃生理盐水80 mL，快速断头取脑,在冰浴上分离出完整海马，存放于

-80 ℃冰箱，称左侧海马湿重，加RIPA 裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF，超声匀浆后，4 ℃、14 000 r/min 离心 10 min，取上清液，用 BCA法测上清液浓度。蛋白样品用 6%SDS-PAGE 于常温下以 30 V、20 min，

80 V、30 min，120 V、50 min进行电泳。电泳结束

后，4 ℃、300 mA将蛋白质从 SDS-PAGE 转到 PVDF膜上。转膜后用5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭2 h，加入一抗（兔多克隆抗体NR2A，1∶200；兔多克隆抗体 NR2B，1∶1500；抗小鼠 β-actin，1∶1000），4℃孵育过夜，TBST 洗涤 3 次×10 min；加入二抗（山羊抗兔 IgG，1∶10 000），室温下摇动孵育 1h，TBST洗涤 3 次×10 min。避光将显影剂的底物A液和B液以 1∶1 混合后均匀覆盖至 PVDF 膜上，在凝胶成像系统中拍照、观察。目的条带采用 Bio-Rad 图像分析软件进行光密度积分值分析，目的蛋白与 β-actin 灰度值比值表示蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法

采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s 表示，水迷宫定位航行实验结果进行重复测量方—差分析，其他指标采用方差分析，组间比较采用两两比较，方差不齐时用 Dunnett's t 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris 水迷宫实验结果定位航行实验：与对照组比较，模型组小鼠逃避

潜伏期明显延长（P＜0.01）；与模型组比较，电针组

小鼠逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05），见表 1。空间探索实验：与对照组比较，模型组小鼠原平台象限停

留时间明显缩短（P＜0.01），跨越原平台次数明显

减少（P＜0.01）；与模型组比较，电针组小鼠原平台

象限停留时间明显延长（P＜0.01），跨越原平台次数

增多（P＜0.05）。见表 2、图 1。

2.2 免疫组化染色结果与对照组比较，模型组小鼠NR2A平均光密度显

著升高（P＜0.01），NR2B 平均光密度值显著降低

（P＜0.01）；与模型组比较，电针组小鼠 NR2A 平均

光密度显著降低（P＜0.01），NR2B 平均光密度值显

著升高（P＜0.01）。见表 3、图 2 和图3。

—

2.3 Western blot 检测结果与对照组比较，模型组小鼠NR2A相对表达量显

著升高（P＜0.01），NR2B 蛋白相对表达量显著降低

（P＜0.01）；与模型组比较，电针组小鼠蛋白 NR2A

相对表达量降低（P＜0.05），NR2B 蛋白相对表达量

显著升高（P＜0.01）。见表 4。3 讨论

AD属中医学“呆证”“健忘”等范畴，其基本病机为肾衰髓虚，髓减脑消，神机失用。AD病位在脑，根据经络理论，“督脉者，起于下极之俞，并于脊里，上至风府，入属于脑”（《难经•二十八难》），可见，督脉与脑密切相关，历代医家素有“病变在脑，首取督脉”之说。因此，从督脉调治AD越来越受到重视[10]。百会位于巅顶，其深处为脑之所在，具有醒脑开窍、安神益智的功效，是调节脑功能、治疗脑部疾病的要穴。大椎是手足六阳经的交会穴，为“诸阳之会”，总督一身之阳气，是升阳开窍、健脑调神的效穴。百会和大椎属督脉穴，两穴结合可使诸经通调，促进经气运行，濡养脑髓气血，促进阴阳平衡。《医学心悟》认为“肾主智，肾虚则智不足，故喜忘其前言”，唐容川《中西汇通医经精义》指出：“事物之所以不忘，赖此记性，记在何处，则在肾精。益肾生精，化为髓，而藏之于脑中。”肾藏精生髓，肾俞为肾的背俞穴，肾中精气汇集于此，具有补益肾气、调节督脉之功；

肾经与督脉相连，入髓连络脑海。根据相关文献[11]

和我们前期研究[5-6，12]，本实验应用“益肾调督”法，选取“百会”“大椎”和“肾俞”为治疗腧穴。

针灸在防治衰老性疾病中发挥着巨大优势，治疗AD受到越来越多的重视与关注[13]。研究发现，电针“肾俞”“百会”能减少海马Aβ沉积，降低 tau 蛋白的过度磷酸化，从而改善AD模型大鼠认知损伤；益肾调督针灸法可能通过减少或抑制 AD 大鼠血清内Aβ水平，降低大鼠海马CA1区淀粉样前体蛋白的表

达[11] 。这与我们前期的研究[5-6，12]相一致。突触是神经元传递信息的主要结构，是学习与记忆形成的重要

形态学和功能学基础[14]。研究表明，电针治疗明显增

加突触面积与体积，提高突触素表达水平[15]，增加

CA1 区神经元的突触数量，改善突触超微结构[16]；电针“百会”“肾俞”能提升AD大鼠海马CA1 区 SYN、

PSD-95 蛋白水平，促进突触可塑性的增强[17]。改善突触功能被认为是减轻AD认知损伤的有效治疗方式[18]。

NMDA受体是一种重要的离子型谷氨酸能受体，

广泛分布于中枢神经系统，尤其海马部位[19]。NMDA受体包括 3 种亚单位，分别是 NR1、NR2（NR2A～

NR2D）和 NR3（NR3a、NR3b）[20]。NMDA 受体在突触可塑性的调控中起重要作用，参与学习和记忆的

产生和维持过程[21]，这与 NMDA 受体的功能单位

NR2A 和 NR2B 亚基密切相关。研究表明，NR2A缺失的小鼠快速获得性空间工作记忆发生了障碍，而上调 NR2A的表达能损害空间工作记忆能力；NR2A基因突变小鼠表现为在新环境中自发运动增强和潜在

学习能力降低[22]。NR2B亚基表达减少的大鼠表现出的学习记忆能力较正常大鼠下降，而给予上调NR2B表达的药物可增强长时程作用，改善大鼠学习记忆能

力[23]。本实验通过免疫组化和免疫印记检测显示，电针组 NR2A蛋白表达明显低于模型组，NR2B蛋白表

达明显高于模型组。邱文兴等[24]发现，电针治疗能提高 NR2B mRNA的表达，改善学习记忆能力。这与本实验结果相一致。

我们前期研究表明，电针 SAMP8 小鼠“百会” “大椎”“肾俞”可提高海马CA1区神经元突触蛋白

的表达，改善突触的超微结构[6]。因此，结合本实验

结果，我们认为电针改善 AD 小鼠学习记忆能力的机制可能与电针抑制海马神经元 NR2A 的表达和促进 NR2B 的表达相关。但是本实验未设置非穴位组，缺少与非穴位治疗的对比，将在今后实验中进一步完善。

参考文献：

[1] SHENG M, SABATINI B L, SUDHOF T C. Synapses and Alzheimer’s disease[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology,2012,4(5)：

747-749.

[2] PURRO S A, DICKINS E M, SALINAS P C. The secreted Wnt antagonist

Dickkopf-1 is required for amyloid β-mediated synaptic loss[J]. Journal of Neuroscience,2012,32(10)：3492-3498.

[3] WANG H, PENG R Y. Basic roles of key molecules connected with NMDAR signaling pathway on regulating learning and memory and synaptic plasticity[J]. Mil Med Res,2016,3(1)：26.

[4] DONG W, GUO W, ZHENG X, et al. Electroacupuncture improves cognitive deficits associated with AMPK activation in SAMP8 mice[J]. Metabolic Brain Disease,2015,30(3)：777-784.

[5] 董卫国,林岚,王丰,等.电针对SAMP8小鼠海马线粒体呼吸链功能的影

响[J].中国针灸,2012,32(8)：726-730.

[6] 李斐斐,杨珺,杨文丹,等.电针百会、大椎、肾俞穴对SAMP8 小鼠学习记忆与海马 CA1 区神经元突触的影响[J].中国康复理论与实践,2017,

23(11)：1278-1283.

[7] MORLEY J E, FARR S A, KUMAR V B, et al. The SAMP8 mouse：a model to develop therapeutic interventions for Alzheimer's disease[J]. Current Pharmaceutical Design,2012,18(8)：1123-1130.

[8] MORLEY J E, ARMBRECHT H J, FARR S A, et al. The senescence accelerated mouse (SAMP8) as a model for oxidative stress and Alzheimer's disease[J]. BBA-Molecular Basis of Disease,2012,

1822(5)：650-656.

[9] 余曙光,郭义.实验针灸学[M].北京：人民卫生出版社,2012：252.

[10] 沈峰,孙国杰,杜艳军,等.针灸从益肾调督论治老年痴呆探讨[J].湖

北中医药大学学报,2013,15(2)：44-46.

[11] 陈阳阳,孔立红,孙国杰,等.“益肾调督”针灸法对 AD 大鼠血清 Aβ及海马 APP 表达的影响[J].时珍国医国药,2016,27(9)：2289-2291.

[12] 王丰,吕东,李长征,等.电针对 SAMP8 小鼠海马 Beclin-1 表达的影

响[J].山西医科大学学报,2015,46(8)：721-723.

[13] 蒋丽,王海明,钟兰.阿尔茨海默病针灸研究进展[J].新中医,2009,

41(1)：117-119.

[14] 张永杰,唐冬梅,徐桂萍.突触可塑性分子机制的相关研究[J].医学

综述,2012,18(8)：1141-1143.

[15] 王威,唐伟,孙忠人.电针对拟老年性痴呆大鼠学习记忆功能和海马

CA1 区突触表达的影响[J].中国中医药科技,2011,18(1)：1-2.

[16] 宋长明,黄佳,林冰冰,等.电针百会、神庭穴对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力及海马 CA1 区突触超微结构的影响[J].中国康复理论与实

践,2017,23(7)：750-755.

[17] 张亢亢,孔立红,王颖,等.不同频率电针对AD大鼠海马CA1 区突触素和 PSD-95 表达的影响[J].时珍国医国药,2016,27(10)：2539-2542.

[18] SPIRES-JONES T L, HYMAN B T. The intersection of amyloid beta and tau at synapses in Alzheimer's disease[J]. Neuron,2014,82(4)：

756-771.

[19] MAQSOOD R, STONE T W. The gut-brain Axis, BDNF, NMDA and CNS disorders[J]. Neurochem Res,2016,41(11)：2819-2835.

[20] PREGNO G, ZAMBURLIN P, GAMBAROTTA G, et al. Neuregulin1/

ErbB4-induced migration in ST14A striatal progenitors：calciumdependent mechanisms and modulation by NMDA receptor activation[J]. BMC Neurosci,2011,12：103.

[21] WANG H, PENG R Y. Basic roles of key molecules connected with NMDAR signaling pathway on regulating learning and memory and synaptic plasticity[J]. Mil Med Res,2016,3(1)：26.

[22] BANNERMAN D M, NIEWOEHNER B, LYON L, et al. NMDA receptor subunit NR2A is required for rapidly acquired spatial working memory but not incremental spatial reference memory[J]. J

Neurosci,2008,28(14)：3623-3630.

[23] 张蔓,孟涛,赵文锦,等.丙烯酰胺对雌性Wistar大鼠学习记忆和长时

程增强的影响及其可能机制[J].中国药理学与毒理学杂志,2017,

31(1)：87-93.

[24] 邱文兴,张玉瑶,张晓东,等.电针对阿尔茨海默病大鼠海马 CA1 区天门冬氨酸受体 NR2B mRNA 表达的影响[J].针灸临床杂志,2010,26(6)：

56-58.

（收稿日期：2018-09-06）

（修回日期：2018-09-30；编辑：华强）