CJI (Traditional Chinese Medicine)
健脾解毒方对过表达HBx 肝癌 HepG2 细胞 PI3K/AKT 通路的影响
张斌，王晓薇，徐春江，丁慎华，朱薇珊，钱雪梅(56)
张斌，王晓薇，徐春江，丁慎华，朱薇珊，钱雪梅
复旦大学附属中山医院青浦分院，上海 201700
摘要：目的 观察健脾解毒方对过表达乙型肝炎病毒 X 蛋白（HBx）的肝癌细胞增殖及 PI3K/AKT 信号通路相关因子表达的影响。方法 构建过表达HBx 肝癌的 HepG2细胞，给予不同浓度健脾解毒方药物血清进
行干预，实验分为肝癌细胞空白组、pcDNA3.1 组、pcDNA3.1-HBx 组和健脾解毒方低、中、高剂量组。采用MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖及凋亡水平，采用Western blot 检测肝癌细胞 p-PI3K、p-AKT 蛋白表达。结果 成功构建过表达HBx 的肝癌 HepG2细胞，发现有促进肝癌细胞增殖及上调p-PI3K 及 p-AKT 表达的作用。健脾解毒方药物血清干预后，可不同程度抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡，以及下调p-AKT、p-PI3K表达的作用，而健脾解毒方低剂量组对 p-PI3K 表达作用不显著。结论 健脾解毒方有抑制肝癌细胞增殖及促进凋亡的作用，其机制与下调 PI3K/AKT 通路相关因子表达有关。
关键词：肝癌细胞；PI3K/AKT信号通路；乙型肝炎病毒X蛋白；健脾解毒方
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)03-0056-04
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.03.013 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）是发病率较高的恶性肿瘤，其全球发病率和死亡率分别居所
基金项目：上海市卫生计生委基金（201540130）；上海市青浦区科委基金（青科发2016-10）；上海市青浦区卫生计生委学科
带头人基金（WD2015-07）有肿瘤的第7位和第4 位[1]，治疗难度极大，预后很差。目前 PLC 机制尚不清楚，因而加强其发病机制研究，并寻找有效治疗手段是肝癌防治的关键所
在[2-3]。PI3K/AKT 信号通路在肝癌细胞生长、分化、增殖、迁移和存活中扮演重要角色，与肝癌发生发展
密切相关[4-5]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）
慢性感染是肝细胞癌发病的独立高危因素，其中乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）是一种重要的反式作用因子，能广泛激活多种原癌基因的转录表达，是肝细胞恶性转化的重要原因，被认为在肝癌发生过程中发挥直接
促癌作用[6-8]。我们前期通过二甲基亚硝胺诱导大鼠肝癌模型，采用健脾解毒方对其干预后，发现有延缓肝癌发病的作用，其机制与中药下调PI3K/AKT 信号
通路相关因子表达有关[9-10]。为进一步探索其机制，本研究构建过表达HBx 的肝癌 HepG2 细胞，采用健脾解毒方药物血清进行干预，观察其对过表达 HBx的肝癌细胞增殖及PI3K/AKT信号通路相关因子表达的影响。
1 实验材料
1.1 细胞株
肝癌 HepG2细胞，中国科学院上海细胞库提供。采用 RPMI1640 进行细胞培养（培养液含 100 U/mL
青霉素、100 μg/mL 链霉素及10%胎牛血清），其中培养箱条件设置为37 ℃、5%CO2，每隔 3～4 d进行传代，选择对数生长期的肝癌细胞用于实验。
1.2 动物
雄性 SD大鼠 20 只，体质量（100±10）g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号
SXCK（沪）2015-0008。饲养于上海中医药大学附属普陀医院 SPF级动物房，普通饲料喂养，自由饮水。
1.3 药物
健脾解毒方（黄芪38 g，猪苓 15 g，八月札 18 g，麸炒白术24 g，仙鹤草18 g，石见穿18 g，薏苡仁12 g，野葡萄藤 18 g）10剂，饮片由上海中医药大学附属普陀医院药剂科提供，常规水煎浓缩成1000 mL，含原药材 1.5 g/mL，4 ℃冰箱保存备用。
1.4 主要试剂与仪器
胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、RPMI 1640 培养液及小牛血清，Thermo Fisher Scientific 公司；DMSO、MTT 和 Trizol RNA 试剂，Sigma 公司；鼠抗人 SEPP1单克隆抗体及兔抗人GAPDH单克隆抗体，上海碧云
天生物技术有限公司。96 孔培养板，Nunc 公司；电子天平，MettlerToledo 公司；CO2培养箱，Binder 公
司；CK40 型多功能倒置相差显微镜，Olympus公司。2 实验方法
2.1 中药药物血清制备
大鼠随机分为健脾解毒方药物血清组和对照组。健脾解毒方药物血清组大鼠给予50 g/kg 健脾解毒方灌胃（按成人体质量用药剂量换算），对照组大鼠灌服等体积生理盐水，连续5d。实验前禁食12 h，末次给药后2 h。腹主动脉采血，离心，分离血清，56 ℃灭活，使用 0.22 μm微孔过滤除菌，分装，置于-80 ℃冰箱保存。
2.2 重组表达载体的构建及鉴定用限制性内切酶XhoI和EcoRI对Plvx-ires-zsgreen1表达载体和目的片段分别进行双酶切，酶切产物采用DNA凝胶回收试剂盒回收，取4 μL回收后的目的片段与 2 μL 载体，用1 μL T4 DNA连接酶于 16 ℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，接种于含氨苄的LB 平板上培养，37 ℃过夜培养，次日挑单克隆扩大培养并小量提取质粒，对提取的重组质粒进行 EcoRI 单酶切鉴定，同时进行 PCR 扩增并用琼脂糖凝胶电泳检测。将鉴定结果正确质粒和阳性菌送到上海华大基因生物公司进行测序。
2.3 细胞培养
将冻存于液氮中的 HepG2 细胞接种于含 10%胎牛血清DMEM 培养液中，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，细胞处于对数生长期时进行传代，每2～
3 d 换液1次，长满后常规胰蛋白酶消化法传代培养。
48 h 后收集细胞进行实验。实验分为肝癌细胞空白
组、pcDNA3.1 组（将空质粒 pcDNA3.1 转染肝癌细
胞后进行培养）、pcDNA3.1-HBx 组（将 HBx 转染肝癌细胞后进行培养）和中药低剂量组（在 pcDNA3.1HBx转染肝癌细胞后加入体积分数为 10%健脾解毒方药物血清）、中剂量组（在 pcDNA3.1-HBx 转染肝癌细胞后加入体积分数为 15%健脾解毒方药物血清）、高剂量组（在 pcDNA3.1-HBx 转染肝癌细胞后加入体积分数为20%健脾解毒方药物血清）。
2.4 MTT法检测细胞增殖取对数生长期的肝癌细胞接种于96孔培养板中，细胞浓度为1×104，每孔约 200 μL。培养 24 h 后，弃培养液，重新加入温育液，于培养24 h 及 48 h 每孔加入 20 μL MTT 液（5 mg/mL），培养 4 h后弃上清，加入DMSO，采用酶标仪进行测定，于酶标仪490 nm
波长处测量吸光度（OD）。抑制率（%）＝（1－用药组平均OD值÷对照组平均OD 值）×100%。
2.5 细胞凋亡率检测
收集培养肝癌细胞，1000 r/min 离心 5 min，弃上清液，PBS进行清洗2 次，将缓冲液、AnnexinⅤ-FITC抗体及 PI 染液依次加入，室温避光放置 15 min，流式细胞仪进行检测。实验重复3 次。
2.6 Western blot 检测 p-PI3K、p-AKT 蛋白表达以 RIPR 裂解液收获细胞，4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min，取上清液并测定蛋白浓度；蛋白上样量为
20 μg，SDS PAGE 胶浓度为8%，蛋白转移至 0.45 μm PVDF 膜上，孵一抗（p-PI3K、p-AKT、GAPDH 抗体均为1 ∶1000）4 ℃过夜，TBST 洗涤3次，孵二抗
1 ∶2000，室温 2h；TBST 洗涤 6 次；ECL发光试剂盒暗室发光、显影、定影。Bio-Rad 凝胶成像系统获取图像，采用 Image J图像软件计算灰度值。3 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s — 表示，两组间均数比较采用t 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 真核表达载体 pcDNA3.1（+）-HBx 构建及鉴定将 pcDNA3.1（+）酶切片段与 HBx 片段连接，阳性克隆通过 XhoI 和 XbaI进行双酶切，用于连接和转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑单克隆进行培养扩增，提取质粒，限制性内切酶 XhoI 对重组质粒进行单酶切鉴定，电泳结果显示有 235 bp 的HBx 条带和 4128 bp 的载体条带，与预期片段大小相符，经测序进一步证明插入基因正确，获得
pcDNA3.1（+）-HBx 载体，表明HBx表达载体构建成功。见图1、图 2。4.2 健脾解毒方对肝癌细胞增殖的影响与肝癌细胞空白组比较，pcDNA 3.1-HBx 组肝癌
细胞抑制率显著降低（P＜0.01）；与 pcDNA 3.1-HBx组比较，中药各剂量组肝癌细胞抑制率显著升高（P＜
0.01）。见表 1。
5 讨论
HBV 慢性感染是肝癌发病的独立高危因素。整合的 HBV-DNA 基因组编码的 HBx 是一种重要的反式作用因子，能广泛激活多种原癌基因的转录表达，是肝细胞恶性转化的重要原因，被认为在肝癌发生过
程中发挥直接促癌作用[6]。HBx蛋白可干扰癌细胞间的黏附连接，促进细胞外基质降解，诱导肝癌细胞发生上皮间叶表型转化，促进肝细胞癌侵袭转移。HBx在肝癌发病中与多种信号通路的参与密切相关，其中Wang 等[7]将 HBx基因转染HepG2肝癌细胞后发现有促进肝癌细胞增殖，其机制与激活PI3K/AKT 信号通路的表达有关。Liu 等[8]采用转染 HBx基因的肝癌细胞接种裸鼠后发现有促进肿瘤转移的作用，其机制与
PI3K/AKT 信号通路的激活有关。本研究成功构建了过表达 HBx 的真核表达载体，通过转染肝癌 HepG2细胞后，也发现有促进肝癌细胞增殖作用，表明HBx与肝癌的发生发展密切相关。
PI3K是一种脂类激酶，活化的PI3K 可将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸转化为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸
（PIP3）。PIP3 可使其主要下游底物AKT准确定位到近膜区并发生构象变化，同时活化的 AKT 转位到细胞质和细胞核内，作用于下游底物，调控细胞代谢、蛋白合成、细胞增殖与凋亡等重要生理过程，参与细
胞生长、增殖及分化调节。PI3K/AKT 信号通路是一条广泛存在于细胞中的信号转导通路，在细胞增殖调控中起重要作用，其表达异常存在于多种癌细胞中，尤其与肝癌发病关系密切。本研究对过表达 HBx 的肝癌细胞进行了研究，发现 HBx 促进肝癌细胞增殖作用与上调 p-PI3K 及 p-AKT 的表达有关。
肝癌属中医学“臌胀”“肝积”“积聚”等范畴。多由饮食不节（洁）、情志不遂、劳倦等多种因素引起邪毒内生而引起，病机特点是本虚标实，本虚以脾气虚为主，标实为邪毒（热、湿热毒邪）郁肝，治以益气健脾、理气解毒。健脾解毒方为上海中医药大学范忠泽教授经验方，对多种恶性肿瘤有抑制作用，该方由黄芪、白术、猪苓、枳壳、八月札、石见穿及野葡萄藤等组成，具有健脾益气、化湿解毒功效。既往研究发现该方具有提高免疫、改善脏器功能及抗多种
消化道肿瘤等功效，尤其对肝癌有较好的疗效[11-12]。我们前期研究中发现，该方可较好延缓二乙基亚硝胺诱导大鼠肝癌的发生和发展，其机制部分与调控
PI3K/AKT 信号通路的表达有关[9-10]。本研究采用健脾解毒方对过表达HBx的肝癌HepG2细胞开展研究，发现中药各剂量组有抑制肝癌细胞增殖作用，其机制与下调 p-AKT 蛋白表达有关（P＜0.01），进一步通过对 p-PI3K 表达情况进行研究，发现除低剂量组作用不显著外，中药中、高剂量组均显著下调 p-PI3K 的表达（P＜0.01），表明健脾解毒方抑制肝癌细胞作用可能与下调 p-AKT 及 p-PI3K 蛋白表达有关。
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（收稿日期：2018-09-17）
（修回日期：2018-10-17；编辑：华强）