CJI (Traditional Chinese Medicine)
益气通阳方对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响
韩成鹏,马华,李荣荣,李军娜(60)
韩成鹏1,马华2,李荣荣1,李军娜 1
1.山西医科大学,山西 太原 030000;
2.山西医科大学第二医院,山西 太原 030000
摘要:目的 观察益气通阳方对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾间质纤维化及 TGF-β1/Smad7 信号通路的影响,探讨其可能的作用机制。方法 将 40 只 SD大鼠随机分为假手术组、模型组、中药组和西药组各10 只。除假手术组外,其余各组建立 UUO 模型。西药组予依那普利溶液 0.18 mg/mL 灌胃,中药组予益气通阳方浓缩液 1.188 g/mL灌胃,假手术组和模型组予等量生理盐水灌胃,每日1 次。14 d后心脏取血检测大鼠血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)水平,处死大鼠取其肾组织行 HE 和 Masson 染色,免疫组化检测肾组织转化生
长因子-β1(TGF-β1)和纤维连接蛋白(FN)的表达,Western blot 和 RT-PCR 分别检测 Smad7 蛋白和mRNA的表达。结果 与假手术组比较,模型组大鼠血清SCr、BUN 明显升高(P<0.01),病理改变明显,TGF-β1、FN 蛋白表达明显升高(P<0.01),Smad7 蛋白和 mRNA 表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,中药组和西药组大鼠血清SCr、BUN 明显降低(P<0.05),病理改变减轻,TGF-β1、FN 蛋白表达明显降低(P<0.05),
Smad7 蛋白和 mRNA 表达明显升高(P<0.05)。结论 益气通阳方可能通过上调 Smad7 表达,抑制 UUO 大鼠肾组织 TGF-β1的高表达,进而延缓肾间质纤维化进展。
关键词:肾间质纤维化;益气通阳方;转化生长因子-β1;Smad7信号蛋白;大鼠
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2019)03-0060-05
DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2019.03.014 开放科学(资源服务)标识码(OSID):
基金项目:全国名老中医药专家传承工作室建设项目(2014年)
通讯作者:马华,E-mail:mahua1022@aliyun.com
its mRNA expression significantly increased (P<0.05). Conclusion Yiqi Tongyang Decoction can reduce renal interstitial fibrosis possibly by inhibiting the expression of TGF-β1 and up-regulating the expression of Smad7 in UUO rats.
Keywords: renal interstitial fibrosis; Yiqi Tongyang Decoction; TGF-β1; Smad7 signaling proteins; rats
肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)是进行性肾损害的主要病理特征,以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的堆积和间质成纤维细胞的增生为主要表现,是各种肾脏病变进展到终末期
的共同病理学机制[1]。转化生长因子-β1(TGF-β1)是公认的促纤维化细胞因子,且 TGF-β1/Smads 信号通路是 RIF最主要的通路[2]。因此,探索能阻断该信号通路的药物对延缓和治疗RIF具有重要意义。益气通阳方是全国名老中医薛秦教授治疗慢性肾脏病的经验方,临床上治疗慢性肾衰竭疗效较好。本研究通过单侧输尿管梗阻(UUO)建立大鼠RIF 模型,采用益气通阳方进行干预,与血管紧张素转化酶抑制剂依那普利进行对照,观察大鼠肾脏病理及功能改变并进一步探索 TGF-β1、Smad7 信号蛋白在其中的作用,探讨其可能的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF 级健康雄性 SD 大鼠 40 只,6~8 周龄,体
质量(200±10)g,山西医科大学实验动物中心提供,动物许可证号 SCXK(晋)2015-0001。饲养于山西医科大学实验动物中心SPF 级动物房,温度(22±2)℃,相对湿度 45%~50%,12 h光照,自由摄食饮水。
1.2 药物
益气通阳方(黄芪15 g,红花 10 g,大黄 8 g,土鳖虫6g,白花蛇舌草 15 g,淫羊藿 12 g),饮片由山西医科大学第二医院中药制剂室提供,水煎浓缩为含原药材 1.188 g/mL;马来酸依那普利片,扬子江药业集团江苏制药股份有限公司,批号 17090611,以生理盐水配成 0.18 mg/mL 溶液。
1.3 主要试剂与仪器
TGF-β1 兔抗大鼠单克隆抗体(英国 Abcam 公司),纤维连接蛋白(FN)兔抗大鼠单克隆抗体(英国 Abcam 公司),Smad7兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德公司),GAPDH兔抗大鼠多克隆抗体(博士德公司),Masson 染色试剂盒(福州迈新生物公司),即用型 SABC-POD(兔 IgG)试剂盒(博士德公司),总 RNA 提取试剂盒(9767)、PrimeScript RT reagent kit with gDNA(RR047A)和 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试
剂盒(RR820A),日本 Takara 公司。光学显微镜(日本 Olympus 公司),Scanscope 数字病理扫描系统(美国 Aperio 公司),LightCycler480 实时荧光定量 PCR仪(瑞士 Roche 公司)。
2 实验方法
2.1 分组、造模和给药按随机数字表法将 40 只大鼠分为假手术组、模型组、中药组和西药组,每组10只。除假手术组外,
参照文献[3]方法制作 UUO大鼠模型,假手术组开腹后只游离左侧输尿管不进行结扎。造模后第1日开始给药,西药组予依那普利溶液0.9 mg/(kg•d)灌胃,中药组予益气通阳方 5.94 g 原药材/(kg•d)灌胃,假手术组和模型组予等量生理盐水灌胃。给药体积均为
1 mL,连续 14 d。中药组和西药组给药剂量按动物与
人体的体表面积换算[4]。
2.2 标本收集及处理
于造模后第15日,2%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠,固定后心脏取血3~5 mL,3000 r/min 离心5 min,收集血清。处死大鼠后取左肾,去除肾包膜后放出积水。将左肾沿冠状面用手术剪剖开,分切肾组织,部分于
4%多聚甲醛溶液中固定 24 h,常规脱水、透明、浸蜡、包埋,制成4 μm薄片,其余组织迅速置于液氮中冻存备用。
2.3 观察指标及检测方法
2.3.1 血生化指标检测收集血清,全自动生化分析仪检测血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN),由山西医科大学第二医院检验科完成。
2.3.2 肾脏组织常规染色
按常规方法行 HE 和 Masson 染色,中性树胶封片,光学显微镜下观察肾脏组织病理学改变。
2.3.3 免疫组化检测转化生长因子-β1、纤维连接蛋白的表达
将肾组织石蜡切片(4.0 μm)常规脱蜡水化,加
3%过氧化氢室温孵育10 min,热抗原修复,5%BSA封闭液室温封闭30 min,滴加一抗(TGF-β1 按 1∶300稀释,FN按 1∶1000 稀释),4 ℃冰箱过夜。37 ℃复温 30 min,滴加二抗 37 ℃孵育 30 min。滴加 SABC液 37 ℃孵育 20 min。DAB显色,显微镜下控制反应时间,水洗后复染,脱水、透明、封片。采用 PBS
替代一抗的方法作为阴性对照。应用数字病理扫描系统观察 TGF-β1、FN的表达及定位情况,计算阳性染色的平均灰度值,每张切片在200 倍镜下随机选取5个视野计算阳性染色的灰度值,灰度值越高表明相应蛋白表达越低。
2.3.4 Western blot 检测 Smad7 蛋白的表达取肾组织,按10 mg组织加入 100 μL RIPA 裂解液匀浆,裂解充分后13 000×g、4 ℃离心,取上清液,用 BCA法进行蛋白定量。取等量蛋白样本100 ℃加热 5 min,使蛋白变性,变性后的蛋白贮存于-20 ℃用于后续实验。取40 μg等量变性过的蛋白样本经电泳、转膜、封闭后,滴加兔抗 Smad7 抗体(1∶300
稀释),4 ℃孵育过夜,TBST洗膜,再加辣根过氧化
物酶标记的二抗(1∶2500 稀释),室温孵育 2h,TBST洗膜,ECL化学发光法曝光。以GAPDH作为内参照,通过计算目标蛋白与GAPDH蛋白的灰度比值进行半定量分析。
2.3.5 RT-PCR 检测 Smad7 mRNA的表达引物序列取自NCBI Nu-cleotide Database 数据库,经 Primer软件设计与检验,大连宝生物工程有限公司
合成。Smad7 上游:5'-AGAAGATATCCAGGGAGG
GCTCTT-3',下游:5'-CGCTGTACCTTCCTCCGAT-3',产物长度 182 bp;β-actin 上游:5'-GCCCCTGAGGA
GCACCCTGT-3',下游:5'-ACGCTCGGTCAGGATCT
TCA-3',产物长度 300 bp。取大鼠肾组织 30 mg,按总 RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒及扩增试剂盒说明书分别提取各组总RNA及反转录合成cDNA模板,取 2 μL cDNA 用于 RT-PCR。β-actin mRNA作为内参
照。反应条件:94 ℃、30 s,95 ℃、20 s,57 ℃、
30 s,72 ℃、60 s 45 个循环;95 ℃、30 s,60 ℃、
60 s,95 ℃、30 s。在每个循环延伸末收集荧光信号,绘制扩增曲线,检测各样本的阈值循环数(CT值),以 2-ΔΔCT法对目的基因进行相对定量分析。3 统计学方法
采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。实验数据用x±s — 表示,计量资料用方差分析,组间两两比较用LSD
法。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果4.1 益气通阳方对模型大鼠血清肌酐和尿素氮的影响与假手术组比较,模型组大鼠血清SCr、BUN 明
显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药组和西药组大鼠血清 SCr、BUN 明显下降,
差异有统计学意义(P<0.05);中药组和西药组比较
差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。4.2益气通阳方对模型大鼠肾脏病理形态的影响
肉眼观察,假手术组大鼠梗阻侧肾脏外观正常,有光泽、呈红褐色,形态规则,质地柔韧;造模组大鼠梗阻侧肾脏体积不同程度增大,形态不规整,肾皮质变薄,有肾积水。HE和 Masson 染色结果显示,假手术组大鼠肾组织形态正常,肾小球和肾小管大小形态正常,肾小管排列整齐致密,未见肾小管扩张,肾间质可见少量蓝色的胶原纤维沉积;模型组大鼠梗阻侧肾脏可见部分肾小管上皮细胞空泡变性,部分管腔扩张,肾间质水肿和大量炎性细胞浸润,肾间质和肾小管出现大量蓝色的胶原纤维沉积;中药组和西药组大鼠梗阻侧肾脏炎性细胞浸润、肾小管扩张程度和间质胶原纤维沉积程度均较模型组减轻。见图1、图 2。
4.3 益气通阳方对模型大鼠肾组织转化生长因子-β1、纤维连接蛋白表达的影响
正常大鼠肾组织 TGF-β1 的表达主要在肾小管上皮细胞中,肾小球中基本没有表达,而FN的表达主要位于肾小球系膜区。假手术组大鼠 TGF-β1 和 FN表达较弱,着色浅淡;模型组大鼠 TGF-β1 和 FN 的表达较假手术组明显增强,呈棕褐色颗粒样沉积,着色较深,与假手术组比较差异有统计学意义(P<
0.01);与模型组比较,中药组和西药组大鼠 TGF-β1和 FN 蛋白表达明显降低(P<0.05);中药组和西药组 TGF-β1、FN 蛋白表达差异无统计学意义(P>
0.05)。见表 2、图 3 和图4。
4.4 益气通阳方对模型大鼠肾组织 Smad7 蛋白和mRNA表达的影响
与假手术组比较,模型组大鼠 Smad7 蛋白和mRNA 表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药组和西药组大鼠 Smad7 蛋白和mRNA 表达明显升高,差异有统计学意义( P<
0.05)。见表 3、图 5。5 讨论多种病理因素(如氧化应激、组织炎症、成纤维细胞的异常增生与活化及多种细胞因子的大量释放)可导致 ECM 的合成与降解紊乱,最终引起纤维化的
产生[5]。既往研究表明,在 RIF过程中,大量释放的细胞因子 TGF-β1 能够促进 ECM 的合成与聚集,从
而加速纤维化的进程[6]。ECM的过度积聚主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及FN的沉积,而FN 是 ECM 的重要组成成分,是目前评价RIF 程度较常用的指标[7]。病理状态下,异常分泌的 TGF-β1 可通过多条途径推动纤维化的进展,而 Smads 信号蛋白是 TGF-β1 信号能否发挥作用的重要调节靶点。目前发现的 Smads成员有9个,按功能可分为活化型、共同通路型以及
抑制型三类[8]。Smad7 蛋白的正常表达可抑制异常激活的 TGF-β1/Smads 信号通路,而纤维化过程中,
Smad7 蛋白表达受到抑制则是 TGF-β1 下游通路过度
激活的重要原因之一[9]。本研究通过检测 TGF-β1 及
Smad7表达,对益气通阳方改善大鼠RIF 的可能机制进行探索。
RIF属中医学“癃闭”“肾劳”“肾风”“溺毒”等
范畴。本病病机为本虚标实[10],主要以脾肾气虚、肾阳衰败为本,湿浊、瘀毒为标。经曰:“邪之所凑,其气必虚”;《医宗必读》谓:“气充于外,邪无所容耳”;叶天士又云:“大凡经主气,络主血,久病血瘀”。由于正气虚损,脾肾功能失调,气虚水湿不运,阳虚
气化不行,致使湿浊内蕴,日久化热,瘀毒留滞。本研究针对以上病机予以益气活血、通阳解毒之法,自拟益气通阳方治疗本病,以达到扶正固本、祛邪治标之效。黄芪为君补脾益气,臣以淫羊藿补肾助阳,二药为伍,补虚固本;红花活血化瘀,畅通血脉,与黄芪相配,一通一补,以奏气行血行之效;大黄泻热毒,破积滞,能入血分,破一切瘀血,推陈致新,土鳖虫破积滞、去血积,二药相伍,增强逐瘀泄浊之力;佐以白花蛇舌草清热解毒、利尿除湿,使邪有所出。全方通补兼施,标本兼顾。
本研究结果显示,益气通阳方能减轻肾脏功能损伤以及肾病理改变,使RIF程度明显减轻。与此同时,益气通阳方还能抑制 TGF-β1 的异常表达并上调Smad7 信号蛋白和 mRNA 表达。结果提示,益气通阳方可能通过抑制 TGF-β1 的过表达并解除病理因素对 Smad7蛋白的过度抑制而发挥抗RIF 作用。
综上,益气通阳方能延缓RIF进展,可能是通过上调Smad7信号蛋白并抑制过表达的TGF-β1蛋白发挥作用。
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(收稿日期:2018-07-28)
(修回日期:2018-08-16;编辑:华强)