巴戟天微型饮片工艺优选

2019-03-15 -

魏晓峰1，任晓航2，李祥溦2，刘博男2，史辑 1，2，3，贾天柱 1，2，3

1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600；2.国家中医药管理局炮制原理解析重点实验室，辽宁大连 116600；

3.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁大连 116600摘要：目的优选巴戟天微型饮片切制工艺参数，探讨其是否适用于不同产地来源的巴戟天。方法以蒸制时间、饮片长度、饮片厚度、烘干温度为影响因素，以水晶兰苷、去乙酰车叶草苷酸、甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素、耐斯糖的含量及出膏率、休止角为评价指标，采用正交试验优选巴戟天微型饮片切制工艺，并建立不同产地来源巴戟天微型饮片 HPLC 指纹图谱。结果巴戟天微型饮片最佳切制工艺为：常压蒸制软化30 min，切片长度 3 mm，切片宽度1～2 mm，40 ℃烘干。结论巴戟天微型饮片软化切制工艺简单易行，具有良好的适用性。关键词：巴戟天；微型饮片；切制工艺；正交试验；高效液相色谱法中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)03-0065-06 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.03.015 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

饮片是中药根据需要炮制处理而成的，可直接供临床使用。饮片质量好坏直接影响着中药方剂、汤药的临床疗效[1]。目前《中华人民共和国药典》只对饮片的片、块、丝、段、厚度等进行了相关规定，并未

基金项目：国家自然科学基金（81473350）；辽宁省自然科学

基金（201602490）

通讯作者：史辑，E-mail：lnshiji@163.com对饮片片型、大小等具体参数进行明确规定，因此饮片市场常遵循“以大为优”的原则[2]。规格较大的饮片并不利于中药有效成分煎出，反而导致临床药效不明显。随着现代生活节奏的加快，中药汤剂煎煮服用方式已不能满足患者的需求。市场上出现了诸如颗粒、超微、配方颗粒、单味浸膏颗粒、破壁[3]等多种形式的饮片，突破了传统饮片携带不方便、煎煮费时费力的局限性，但以上多种饮片形式却忽视了一个最

重要环节——共煎过程，即根据中药相须、相使、相恶、相杀、相畏、相反的“七情”配伍规律，多种化学成分之间的反应均需在煎煮过程中完成，由此产生了微型饮片的概念。微型饮片是直径在 0.5～1.0 cm的丁块状饮片，其片型小于传统饮片，煎出率高于传统饮片[4]。我们期望通过微型饮片改革，制备出规格划一、流动可调，能够智能配方的饮片，使中药调剂接近西药调剂，较传统饮片更有利于有效成分煎出。

本研究以“四大南药”之一的巴戟天为对象，对其微型饮片的软化、切制工艺进行优选。巴戟天为茜草科植物巴戟天 Morinda officinalis How的干燥根，具有强筋骨、补肾阳、祛风湿功效。临床常用于筋骨萎软、宫冷不孕、少腹冷痛、风湿痹痛、月经不调等

症[5]。巴戟天主要含有蒽醌、环烯醚萜苷、多糖、寡

糖等类成分[6]。近年来，巴戟天由于其补肾壮阳[7]、

抗衰老、防抑郁[8]、调节免疫[9]等作用，成为新药研发的热点。巴戟天主产于广东、广西、福建、海南等省，不同产地巴戟天由于加工工艺不同，导致其饮片性状差异较大，形状、长度均不一致。因此，本研究采用正交试验对巴戟天微型饮片的软化、切制工艺进行研究，并建立不同产地来源的巴戟天微型饮片的特征图谱，考察巴戟天微型饮片工艺的可行性。1 仪器与试药

E2695-2998 型高效液相色谱仪，美国 Waters 公

司；H-Class/Xevo TQD型三重四级杆液相质谱联用仪

（配有 MassLynx 色谱工作站），美国 Waters 公司；

KQ-250DB型数控超声波清洗器（功率250 W，频率

40 kHz），昆山市超声仪有限公司；AE240 型 1/10 万

电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；RE52CS型

旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；HH-S4型水浴锅，

郑州长城科工贸有限公司；101 型电热鼓风干燥箱，北京市永光明医疗仪器厂。巴戟天药材来自 10 个产地，分别为广西玉林

（S1）、广西百色（S2）、广东惠州（S3）、福建永定

（S4）、广东韶关（S5）、广东梅州（S6）、广东肇庆

（S7）、福建南靖（S8）、广东德庆（S9）、湖南湘西

（S10），经辽宁中医药大学药学院中药鉴定教研室翟延君教授鉴定，均为茜草科植物巴戟天 Morinda officinalis How的干燥根。耐斯糖对照品（批号 292-64121，纯度≥99.0%，日本 Wako公司），水晶兰苷对照品（批号 O0605AS，

纯度≥98.0%，大连美仑生物技术有限公司），去乙酰车叶草甘酸对照品（批号 J0329AS，纯度≥98.0%，

大连美仑生物技术有限公司），甲基异茜草素-1-甲醚

对照品（自制，纯度＞95.0%），甲基异茜草素对照品

（自制，纯度＞95.0%），水为超纯水，乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯（美国 Merck 公司），其他试剂均为

分析纯。

2 方法与结果2.1 耐斯糖含量测定2.1.1 对照品溶液的制备精密称取耐斯糖对照品1.2 mg，以甲醇-水（3∶ 97）定容至 5 mL容量瓶中，摇匀，即得。2.1.2 供试品溶液的制备精密称取巴戟天微型饮片2g，置于 100 mL 具塞锥形瓶中，加乙酸乙酯30 mL，超声处理（功率 250 W，

频率 40 kHz）30 min，过滤，弃去滤液，滤渣挥干后

加 70%乙醇 50 mL，相同条件下超声处理，过滤，回收乙醇，残渣以甲醇-水（3∶97）定容至25 mL容量瓶中，取续滤液，过 0.22 µm微孔滤膜，即得。

2.1.3 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱（2.1 mm×

100 mm，1.7 µm），负离子模式，流动相为0.1%甲酸

乙腈∶0.1%甲酸-水，体积流量 0.3 mL/min，梯洗脱

程序见表1，进样量 1 µL。液相色谱-质谱图见图1。

2.1.4精密吸取耐斯糖对照品线性关系考察0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL，进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程

Y＝207 888X－1456.92，r²＝

0.999 1，线性范围为 0.004 8～0.240 0 mg。

2.1.5精密吸取同一耐斯糖供试品溶液，在精密度试验 1 d内连续积相同，测得耐斯糖日内峰面积进样 6次，连续6d同一时间分别进样1次，进样体

RSD＝1.7%，日间峰

面积RSD＝1.7%，表明仪器精密度良好。2.1.6 稳定性试验精密吸取同一耐斯糖供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，耐斯糖峰面积RSD＝ 1.8%，表明供试品溶液在 24 h内稳定性良好。2.1.7 重复性试验

取同一样品6 份，制备供试品溶液，按“2.1.3”项下条件测定，测得耐斯糖含量RSD＝1.9%，表明本方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验精密称取已知耐斯糖含量的巴戟天微型饮片6份，每份 1.0 g，按近似 1∶1比例加入耐斯糖对照品，按

“2.1.2”项下方法制备，计算加样回收率。结果耐斯糖平均加样回收率为 99.10%，RSD＝1.73%。2.1.9 样品含量测定

取各组巴戟天微型饮片，按“2.1.2”项下方法制

备供试品溶液，按“2.1.3”项下条件进行测定，进样

量 1 μL，记录峰面积，计算耐斯糖含量。

2.2 水晶兰苷、去乙酰车叶草甘酸含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取水晶兰苷、去乙酰车叶草甘酸对照品各1.5 mg，用80%甲醇定容至 5 mL容量瓶中，摇匀，即得。用时按1∶1比例配成混合对照品溶液。2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取巴戟天微型饮片1g，置于 150 mL 具塞

锥形瓶中，加80%甲醇 100 mL，冷浸 1 h，超声处理

（功率 250 W，频率 40 kHz）1h，过滤，滤液减压

回收，用80%甲醇定容于 10 mL容量瓶中，取续滤液，

过 0.45 m微孔滤膜，即得。

2.2.3 色谱条件

采用 Venusil MP C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，

5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱

（5∶95→28.8∶71.2，15 min），检测波长 235 nm，

体积流量 0.8 mL/min，进样量 2 L，柱温 25 ℃[10]。

色谱图见图2。

2.2.4 线性关系考察精密吸取水晶兰苷、去乙酰车叶草苷酸各2、4、

6、8、10 L，进样测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。结果水晶兰苷回归方程

为 Y＝2 000 000X－4430，r²＝0.999 9，线性范围为

0.300～1.500 mg；去乙酰车叶草甘酸回归方程为Y＝

2 000 000X＋16 844，r²＝0.999 9，线性范围为 0.300～

1.500 mg。

2.2.5 样品含量测定

取各组巴戟天微型饮片，按“2.2.2”“2.2.3”项

下方法制备供试品溶液并测定，进样量2 L，记录峰面积并计算水晶兰苷和去乙酰车叶草甘酸的含量。

2.3 甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素含量测定2.3.1 对照品溶液的制备

精密称取甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素对照品各 2.93 mg，置于 5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。用时按 1∶2 比例配制成混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备精密称取巴戟天微型饮片5g，置于 150 mL 圆底烧瓶中，加入80 mL氯仿，加热回流提取2次，每次

2 h，过滤，合并滤液，回收氯仿，以甲醇定容至10 mL量瓶中，取续滤液，过0.45 m微孔滤膜，备用。2.3.3 色谱条件采用 Ecosil8 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 m），

流动相为乙腈-0.2%磷酸水，梯度洗脱程序见表2，检测波长为 277 nm，流速 0.8 mL/min，进样量 20 L，柱温 30 ℃[11]。色谱图见图 3。

注：A.混合对照品；B.供试品；1.甲基异茜草素-1-甲醚；2.甲基异茜草素

3 1-甲醚 HPLC 2.3.4 图巴戟天中甲基异茜草素、甲基异茜草图线性关系考察

精密吸取甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素对

照品各 3、6、10、13、16 µL，进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。甲基异茜草素回归方程为Y＝5 000 000X＋4 000 000，r²＝0.999 1，线性范围为 1.173～6.256 µg；甲基异茜草素-1-甲醚回归方程为Y＝7 000 000X＋4 000 000，r²＝0.999 9，线性范围为 0.585～3.120 µg。

2.3.5 样品含量测定

取各组巴戟天微型饮片，按“2.3.2”“2.3.3”项下方法制备供试品溶液并测定，进样量20 µL，记录

峰面积并计算样品中甲基异茜草素-1-甲醚和甲基异茜草素的含量。

2.4 出膏率测定取不同工艺制备的巴戟天微型饮片适量，粉碎，

过 2号筛，精密称取4g，置 250 mL具塞锥形瓶中，

精密加入 100 mL水，冷浸，前6 h内时时振摇，静

置 18 h，用干燥滤器过滤，精密量取续滤液20 mL，

置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105 ℃

干燥3h，置干燥器中冷却30 min，精密称定。

2.5 饮片休止角测定取一矩形盒子，装满巴戟天微型饮片，使其疏松

程度适宜，逐渐倾斜盒子，使饮片开始流动，此时倾斜程度即为饮片休止角 θ，tanθ＝H/L（H 为倾斜角高， L 为底边）[12]。2.6 正交试验设计与结果采用正交设计方法，以饮片长度、饮片厚度、干

燥温度及蒸制时间为考察因素，每因素设置3个水平，

用L9（34）正交表设计试验（见表3）。以水晶兰苷、

去乙酰基车叶草甘酸、甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素、耐斯糖总含量（X）及出膏率（Y）、饮片休止角（Z）为评价指标，并将其权重系数分别设定为

0.4、0.4、0.2，进行正交试验，计算综合评分。综合

评分＝0.4X/Xmax＋0.4Y/Ymax＋0.2Z/Zmax，其中 Xmax、Ymax、Zmax为各项指标测定结果的最大值。试验结果

见表4，方差分析见表5。

及烘干温度无显著影响。综合直观分析及方差分析结果，最终确定巴戟天微型饮片的最佳切制工艺为：常

压蒸制 30 min后进行切制，切片长度3 mm、宽度 1～

2 mm，40 ℃烘干。

2.7 验证试验

取3批巴戟天微型饮片（样品1、2、3号）和3份

巴戟天传统饮片（样品4、5、6 号），1、2、3 号样品

按“2.6”项下确定的微型饮片切制工艺制备，4、5、

6号样品按传统饮片切制工艺（加1.0 倍量水于 50 ℃

闷润9h，切段长度 10～15 mm）制备[10]，分别测量耐斯糖、水晶兰苷、去乙酰车叶草甘酸、甲基异茜草

素-1-甲醚、甲基异茜草素的含量及出膏率、饮片休止角，计算综合评分，结果见表 6。可见，6 份样品综合评分均较高，且微型饮片的综合评分均高于巴戟天传统饮片，与正交试验结果相吻合，表明巴戟天微型饮片最佳工艺稳定可行。2.8 指纹图谱检测方法

2.8.1 色谱条件采用 Ecosil8 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 m），

流动相为乙腈-0.2%磷酸水，梯度洗脱程序见表2，检测波长 277 nm，流速 0.8 mL/min，进样量 20 L，柱

温 30 ℃。

2.8.2 对照品溶液的制备

精密称取甲基异茜草素-1-甲醚对照品 2.93 mg，置于 5 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得。2.8.3 供试品溶液的制备取不同产地巴戟天药材 100 g，按上述最佳切制工艺，分别常压蒸制30 min后，切成切片长度3 mm、宽度 1～2 mm，40 ℃烘干，备用。精密称取各巴戟天微型饮片2 g，置于 150 mL圆底烧瓶中，分别加入80 mL氯仿，回流提取2次，每次2 h，过滤，合并滤液，回收氯仿，甲醇定容至10 mL容量瓶中，取续滤液，过 0.45 m微孔滤膜，即得。2.8.4 线性关系考察

精密吸取甲基异茜草素-1-甲醚对照品3、6、10、

13、16 L，进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵

坐标，进行线性回归，得甲基异茜草素-1-甲醚回归方

程 Y＝7 000 000X＋4 000 000，r²＝0.999 9，线性范围

为 1.758～7.618 μg。

2.8.5 指纹图谱的建立

HPLC图谱采用国家药典委员会《中药色谱指纹

图谱相似度评价系统（2004A）》软件，生成指纹图谱共有模式，计算相似度。标定共有峰，以甲基异茜草素-1-甲醚为参照峰，计算共有峰的相对保留时间与相对峰面积。

2.8.6 指纹图谱相似性评价对不同产地巴戟天微型饮片进行指纹图谱测定，结果见图 4。以巴戟天传统饮片色谱图为参照谱，进行自动匹配并计算指纹图谱相似度，结果见表 7。相似度均在 0.90 以上。

2.8.7 指纹图谱共有峰的标定

以巴戟天最佳微型饮片中甲基异茜草素-1-甲醚

（保留时间 34.056 min）的平均峰面积为参考峰，计算不同产地巴戟天微型饮片各共有峰的相对峰面积。

通过不同产地来源的巴戟天指纹图谱测试，共分

离得到 62个色谱峰，其中28个为共有色谱峰，与巴戟天传统饮片色谱图（见图 5）相比，共有峰增加且其相对峰面积明显增大。进一步说明巴戟天切制成微型饮片后，有效成分煎出率有所提高。3 讨论

本试验收集的 10 个不同产地巴戟天药材均来自巴戟天主要产地，经含量测定，均符合2015 年版《中华人民共和国药典》巴戟天项下耐斯糖含量测定的相关规定（耐斯糖不得少于2.0%）。

切制是传统中药炮制工艺的一道重要工序，也是制备微型饮片最关键的工序[13]。为确定微型饮片的粒径及厚度范围，预试验中制备了不同粒径、大小的饮片，并对其煎出液的有效成分含量进行监测，发现粒径大小接近粉末的微型饮片在煎煮过程中极易糊锅，不易过滤，因此确定饮片长度范围为3、5、7 mm，厚度范围为1～2 mm、2～3 mm、3～4 mm。

2015年版《中华人民共和国药典》采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器对耐斯糖的含量进行测定，由于检测器的特殊性，限制其广泛应用。本试验采用超高效液相色谱-四极杆高分辨飞行时间质谱法对耐斯糖的含量进行考察，本方法更加快速、准确。

休止角是评价饮片颗粒流动性的指标，也是采用

自动配方机调剂饮片时的必需参数。休止角＜30°表明饮片流动性好，休止角介于30°～40°表明饮片颗

粒流动性可以满足调剂基本要求，休止角＞40°表明

饮片流动性不好[14]。本试验制备的巴戟天微型饮片休止角均小于30°，符合饮片流动性要求，有利于实现调剂的智能化、自动化。参考文献：

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国中药杂志,2015,40(17)：3343-3346.

[2] 陈士林,黄志海,丘小惠,等.中药精准煮散饮片[J].世界科学技术－

中医药现代化,2016,18(9)：1430-1440.

[3] 成金乐,赖智填,彭丽华.中药破壁饮片研究[J].世界科学技术-中医

药现代化,2014,16(2)：254-262.

[4] 余香,龚千锋,朱龙涛,等.中药传统饮片片型的研究现状与发展[J].江西