淫羊藿黄酮类成分指纹图谱研究

牛晓静，鲁静，段晓颖，徐立然

牛晓静，鲁静，段晓颖，徐立然

河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450008

摘要：目的 建立淫羊藿中黄酮类成分HPLC指纹图谱。方法 采用 Agilent ZORBAX Eclispse SB-C18

色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 µm），以乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱（0～8 min，15%→25%A；8～

25 min，25%A；25～32 min，25%→33%A，32～48 min，33%→38%A；48～60 min，38%→60%A；60～70 min，

60%→85%A；70～75 min，15%A），流速 1.0 mL/min，柱温 30 ℃，检测波长为270 nm，进样量 10 µL。对

11批淫羊藿指纹图谱进行相似度分析及方法学考察。结果 11批淫羊藿药材有21个共有峰，相似度为 0.845～

0.952，对 5 个色谱峰进行了归属；方法学考察结果表明，建立的分析方法重复性、精密度、稳定性良好；相

似度分析将11批淫羊藿分为4大类，与淫羊藿物种鉴定结果一致。结论 不同产地淫羊藿有一定的相似性， HPLC指纹图谱能够为淫羊藿的物种鉴定及内在质量评价提供依据。关键词：淫羊藿；黄酮类成分；指纹图谱；高效液相色谱法中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)03-0088-05 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.03.019 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：淫羊藿为小檗科植物淫羊藿 Epimedium brevicornu Maxim.、箭叶淫羊藿 Epimedium sagittatum （ Sieb.et Zucc. ） Maxim.、柔毛淫羊藿 Epimedium pubescens Maxim.或朝鲜淫羊藿 Epimedium koreanum Nakai的干燥叶，夏、秋季莲叶茂盛时采收，晒干或

基金项目：河南省科技发展计划（152300410105）；河南中医

学院科研苗圃工程项目（mp2015-03）

通讯作者：段晓颖，E-mail：dxy137@sina.com阴干[1]。产地多集中在中国东北、西北、华东、西南

及山西、河南等[2]，由于不同品种在形态特征、生境特征、居群大小、繁殖方式、资源利用状况和地方土名等方面的差异，物种鉴定尚存在诸多疑问[3-4]。指纹图谱是基于对中药物质群整体作用的认识，借助波谱和色谱等技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式，具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点，能对中药内在质量进行有效表征、综

合评价和全面控制[5]。本课题组采用指纹图谱方法对淫羊藿黄酮类成分进行分析，并对5种黄酮类成分进行归属，为淫羊藿的物种归属和鉴定提供一定依据。

1 仪器与试药Waters e2695型高效液相色谱仪（美国沃特世公司），Waters 2998型紫外检测器（美国沃特世公司）， TU-1800PC型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），CP225D 型电子天平（德国赛多利斯集团），BSA224S-CW 型电子天平（德国赛多利斯集团）。11批淫羊藿编号为S1～S11，依次为箭叶淫羊藿

（20140217-1，东北吉林）、淫羊藿（130716，甘肃

陇南）、柔毛淫羊藿（20140303，四川）、箭叶淫羊藿

（20140303-2，甘肃）、淫羊藿（130107，甘肃阳县）、

箭叶淫羊藿（ 20140303-1 ，甘肃）、朝鲜淫羊藿

（20140217-2，东北吉林）、淫羊藿（20140303，陕

西）、箭叶淫羊藿（140301，甘肃陇南）、朝鲜淫羊藿

（131107，辽宁辽阳）、朝鲜淫羊藿（131015，吉林

通化），经本院陈天朝主任药师鉴定，符合2015 年版《中华人民共和国药典》（一部）规定。淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品（批号分别为 110737-200415、111852201102），中国食品药品检定研究院；朝藿定A、朝藿定 B、朝藿定 C（批号分别为 130520、130518、

130601），成都普菲德生物技术有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为高纯水，其他试剂均为分析纯。2 方法与结果

2.1 色谱条件采用 Agilent ZORBAX Eclispse SB-C18 色谱柱

（4.6 mm×150 mm，5 µm），以乙腈（A）-水（B）

为流动相，梯度洗脱（0～8 min，15%→25%A；8～

25 min，25%A；25～32 min，25%→33%A；32～48 min，

33%→38%A；48～60 min，38%→60%A；60～70 min，

60%→85%A；70～75 min，15%A），流速 1.0 mL/min，

柱温 30 ℃，检测波长 270 nm，进样量 10 µL。理论

板数按淫羊藿苷峰计算应均不低于5000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品，精密称定，加甲醇溶解稀释，制成混合对照品溶液，浓度分别为朝藿定A 48.84 µg/mL、朝藿定B 95.2 µg/mL、朝藿定 C 0.1031 mg/mL、淫羊

藿苷 52.5 µg/mL、宝藿苷Ⅰ6.475 µg/mL。

2.2.2 供试品溶液的制备取本品粉末（过3号筛）约 0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，称定质量，

超声处理（功率250 W，频率 40 kHz）1h，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。进样前用0.45 µm微孔滤膜过滤。

2.3 指纹图谱方法学考察

2.3.1 精密度试验

取淫羊藿样品（批号 130716），按“2.2.2”项下

方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，连续测定6次，记录色谱图。以参照峰的保留时间和峰面积为参比，结果供试品溶液中各共有峰相对保留时间的 RSD 为 0.04%～0.971%，相对峰面积的

RSD 为 0.15%～2.97%，表明该方法精密度好。

2.3.2 重复性试验取淫羊藿样品（批号 130716），按“2.2.2”项下

方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析。结果供试品溶液中各共有峰相对保留时间的RSD为 0.13%～1.48%，相对峰面积的 RSD 为 0.56%～

3.20%，表明该方法重复性良好。2.3.3 稳定性试验取淫羊藿样品（批号 130716），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、8、

12、24 h，按“2.1”项下色谱条件进样分析。结果24 h内供试品溶液中各共有峰相对保留时间的 RSD 为0.19% ～ 3.38% ，相对峰面积的 RSD 为 0.526% ～ 2.65%，表明供试品溶液在 24 h内稳定。2.3.4 专属性试验精密吸取空白溶液10 µL，注入色谱仪，按规定的梯度条件洗脱，结果表明阴性对照无干扰。2.4 样品测定

取 11 批淫羊藿样品（见表 1），按“2.2.2”项下

方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果见图1。

2.5 特征指纹图谱的建立

2.5.1 参照峰的选择在各批样品指纹图谱中，淫羊藿苷的保留时间居中，分离度良好，且为淫羊藿的主要黄酮类成分之一，故确定 13号峰淫羊藿苷为参照峰（S）。2.5.2 特征指纹图谱的建立及相似度评价将 11 批淫羊藿色谱图数据导入国家药典委员会

《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）》进行自动匹配，以淫羊藿共有模式图谱为标准，进行整体

相似度评价，11批淫羊藿的相似度为 0.845～0.952，同时确定了 21 个共有峰，根据对照品保留时间与紫外光谱图指认了其中 10、11、12、13、20 号峰分别为朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝藿

苷Ⅰ，共有模式见图2，混合对照品 HPLC 图见图3。

11 批淫羊藿指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积见表1、表2，相似度评价结果见表3。

对各批淫羊藿指纹图谱进行直观分析可见，保留时间 52 min之前的色谱峰有良好的相似度；保留时间在 52～75 min 之间的极性相对较小的成分各批次之

间有较大差异，其中，S1～S9号各色谱图比较相似，与 S10、S11 号色谱图有较大差异。根据相似度评价可以看出，不同产地、批次的淫羊藿有一定的相似性，但也存在一定的差异，各共有峰峰面积差异较大，黄

酮类成分含量有较大差异。S2、S5、S8 相似度在

0.990～0.995，S7、S10、S11 相似度在 0.990～0.995，

S1、S4、S6、S9 相似度在 0.952～0.971。这 3类相似度较高的样品分别为淫羊霍、朝鲜淫羊藿、箭叶淫羊藿，与淫羊藿物种鉴定结果一致，而 S3 与其他批次有差异，为柔毛淫羊藿。

3 讨论指纹图谱在中药质量的综合评价和控制方面有很大的发展，在化学指纹图谱、生物指纹图谱和代谢指纹图谱等技术方面都有突破性的进展。除用于考察中药材的归属、鉴别[6-10]，以提供生产前原料药材真伪优劣的鉴别依据，更可用于中药生产过程的质量控

制，追踪制剂中某些化学成分的变化，监测原料药材与成品之间、成品各批次间质量的一致性及稳定性[11-14]。

淫羊藿因物种来源不同，质量有差异，某些产地样品相似度不好，这给进一步对淫羊藿进行药效学研究带来极大不便。本研究建立了淫羊藿中黄酮类成分

的指纹图谱方法，并对其中5个成分进行指认，方法简便快捷、精密度、重复性良好，结果表明能够客观

反映各共有峰所代表的化学成分含量高低，11批样品

相似度为 0.845～0.952。不同产地、批次的淫羊藿有一定的相似性，但也存在一定的差异，指纹图谱能够为淫羊藿的物种鉴定及内在质量评价提供依据，更能反映出淫羊藿各有效成分含量的综合差异。参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科

技出版社,2015：327.

[2] 徐艳琴,李作洲,张学军,等.三种药用淫羊藿的地理分布于资源调查[J].

武汉植物学研究,2008,26(1)：91-98.

[3] 裴利宽,黄文华,何天谷,等.中药淫羊藿主要资源种类药材质量的系

统研究[J].中国中药杂志,2007,32(21)：2217-2222.

[4] 裴利宽,郭宝林,黄文华.淫羊藿属主要资源种类的HPLC指纹图谱特征

和种类鉴定[J].中国中药杂志,2008,33(14)：1662-1668.

[5] 李强,杜思邈,张忠亮,等.中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展

望[J].中草药,2013,44(22)：3095-3104.

[6] 蒋军富,李雄英,吴耀生,等.绞股蓝的RAPD指纹图谱鉴定及其特异DNA

片段克隆-序列分析[J].中药材,2009,32(2)：190-193.

[7] 聂韡,朱培林,房海灵,等.HPLC 指纹图谱结合化学计量学评价不同产

地广东紫珠药材的质量[J].中草药,2017,48(1)：185-191.

[8] 黄再强,陈玲,张燕飞,等.川产几种葛根类药材资源品种的 UPLC 指纹

图谱[J].中国实验方剂学杂志,2017,23(7)：41-45.

[9] 卢凤来,王磊,颜小捷,等.金银花和山银花的 1H-NMR 指纹图谱鉴别[J].

中成药,2017,39(1)：222-224.

[10] 曾慧婷,沙秀秀,宿树兰,等.不同产地丹参茎叶UPLC指纹图谱与化学

模式识别研究[J].中草药,2017,48(4)：767-772.

[11] 于桂芳,闫显光,殷洪梅,等.益心舒片的HPLC指纹图谱[J].中国实验

方剂学杂志,2017,23(1)：69-74.

[12] 汪露露,何丹丹,王满,等.基于指纹图谱与主成分分析相结合的复方

虎杖方提取工艺研究[J].中草药,2017,48(2)：278-282.

[13] 梁少梅,张鑫,李敏婷,等.清肺愈痤丸HPLC指纹图谱建立及4种成分

测定[J].中成药,2017,39(1)：90-93.

[14] 刘国雄,李华,张军,等.UPLC 指纹图谱快速评价银杏叶提取物及制剂

的质量[J].中国实验方剂学杂志,2017,23(1)：64-68.

（收稿日期：2018-02-27）

（修回日期：2018-05-23；编辑：陈静）