CJI (Traditional Chinese Medicine)
益气通阳方对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响
韩成鹏，马华，李荣荣，李军娜
韩成鹏1，马华2，李荣荣1，李军娜 1
1.山西医科大学，山西 太原 030000；
2.山西医科大学第二医院，山西 太原 030000
摘要：目的 观察益气通阳方对单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠肾间质纤维化及 TGF-β1/Smad7 信号通路的影响，探讨其可能的作用机制。方法 将 40 只 SD大鼠随机分为假手术组、模型组、中药组和西药组各10 只。除假手术组外，其余各组建立 UUO 模型。西药组予依那普利溶液 0.18 mg/mL 灌胃，中药组予益气通阳方浓缩液 1.188 g/mL灌胃，假手术组和模型组予等量生理盐水灌胃，每日1 次。14 d后心脏取血检测大鼠血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）水平，处死大鼠取其肾组织行 HE 和 Masson 染色，免疫组化检测肾组织转化生
长因子-β1（TGF-β1）和纤维连接蛋白（FN）的表达，Western blot 和 RT-PCR 分别检测 Smad7 蛋白和mRNA的表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠血清SCr、BUN 明显升高（P＜0.01），病理改变明显，TGF-β1、FN 蛋白表达明显升高（P＜0.01），Smad7 蛋白和 mRNA 表达明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，中药组和西药组大鼠血清SCr、BUN 明显降低（P＜0.05），病理改变减轻，TGF-β1、FN 蛋白表达明显降低（P＜0.05），
Smad7 蛋白和 mRNA 表达明显升高（P＜0.05）。结论 益气通阳方可能通过上调 Smad7 表达，抑制 UUO 大鼠肾组织 TGF-β1的高表达，进而延缓肾间质纤维化进展。
关键词：肾间质纤维化；益气通阳方；转化生长因子-β1；Smad7信号蛋白；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)03-0060-05
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.03.014 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）是进行性肾损害的主要病理特征，以细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的堆积和间质成纤维细胞的增生为主要表现，是各种肾脏病变进展到终末期
的共同病理学机制[1]。转化生长因子-β1（TGF-β1）是公认的促纤维化细胞因子，且 TGF-β1/Smads 信号通路是 RIF最主要的通路[2]。因此，探索能阻断该信号通路的药物对延缓和治疗RIF具有重要意义。益气通阳方是全国名老中医薛秦教授治疗慢性肾脏病的经验方，临床上治疗慢性肾衰竭疗效较好。本研究通过单侧输尿管梗阻（UUO）建立大鼠RIF 模型，采用益气通阳方进行干预，与血管紧张素转化酶抑制剂依那普利进行对照，观察大鼠肾脏病理及功能改变并进一步探索 TGF-β1、Smad7 信号蛋白在其中的作用，探讨其可能的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF 级健康雄性 SD 大鼠 40 只，6～8 周龄，体
质量（200±10）g，山西医科大学实验动物中心提供，动物许可证号 SCXK（晋）2015-0001。饲养于山西医科大学实验动物中心SPF 级动物房，温度（22±2）℃，相对湿度 45%～50%，12 h光照，自由摄食饮水。
1.2 药物
益气通阳方（黄芪15 g，红花 10 g，大黄 8 g，土鳖虫6g，白花蛇舌草 15 g，淫羊藿 12 g），饮片由山西医科大学第二医院中药制剂室提供，水煎浓缩为含原药材 1.188 g/mL；马来酸依那普利片，扬子江药业集团江苏制药股份有限公司，批号 17090611，以生理盐水配成 0.18 mg/mL 溶液。
1.3 主要试剂与仪器
TGF-β1 兔抗大鼠单克隆抗体（英国 Abcam 公司），纤维连接蛋白（FN）兔抗大鼠单克隆抗体（英国 Abcam 公司），Smad7兔抗大鼠多克隆抗体（武汉博士德公司），GAPDH兔抗大鼠多克隆抗体（博士德公司），Masson 染色试剂盒（福州迈新生物公司），即用型 SABC-POD（兔 IgG）试剂盒（博士德公司），总 RNA 提取试剂盒（9767）、PrimeScript RT reagent kit with gDNA（RR047A）和 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试
剂盒（RR820A），日本 Takara 公司。光学显微镜（日本 Olympus 公司），Scanscope 数字病理扫描系统（美国 Aperio 公司），LightCycler480 实时荧光定量 PCR仪（瑞士 Roche 公司）。
2 实验方法
2.1 分组、造模和给药按随机数字表法将 40 只大鼠分为假手术组、模型组、中药组和西药组，每组10只。除假手术组外，
参照文献[3]方法制作 UUO大鼠模型，假手术组开腹后只游离左侧输尿管不进行结扎。造模后第1日开始给药，西药组予依那普利溶液0.9 mg/（kg•d）灌胃，中药组予益气通阳方 5.94 g 原药材/（kg•d）灌胃，假手术组和模型组予等量生理盐水灌胃。给药体积均为
1 mL，连续 14 d。中药组和西药组给药剂量按动物与
人体的体表面积换算[4]。
2.2 标本收集及处理
于造模后第15日，2%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，固定后心脏取血3～5 mL，3000 r/min 离心5 min，收集血清。处死大鼠后取左肾，去除肾包膜后放出积水。将左肾沿冠状面用手术剪剖开，分切肾组织，部分于
4%多聚甲醛溶液中固定 24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成4 μm薄片，其余组织迅速置于液氮中冻存备用。
2.3 观察指标及检测方法
2.3.1 血生化指标检测收集血清，全自动生化分析仪检测血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN），由山西医科大学第二医院检验科完成。
2.3.2 肾脏组织常规染色
按常规方法行 HE 和 Masson 染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察肾脏组织病理学改变。
2.3.3 免疫组化检测转化生长因子-β1、纤维连接蛋白的表达
将肾组织石蜡切片（4.0 μm）常规脱蜡水化，加
3%过氧化氢室温孵育10 min，热抗原修复，5%BSA封闭液室温封闭30 min，滴加一抗（TGF-β1 按 1∶300稀释，FN按 1∶1000 稀释），4 ℃冰箱过夜。37 ℃复温 30 min，滴加二抗 37 ℃孵育 30 min。滴加 SABC液 37 ℃孵育 20 min。DAB显色，显微镜下控制反应时间，水洗后复染，脱水、透明、封片。采用 PBS
替代一抗的方法作为阴性对照。应用数字病理扫描系统观察 TGF-β1、FN的表达及定位情况，计算阳性染色的平均灰度值，每张切片在200 倍镜下随机选取5个视野计算阳性染色的灰度值，灰度值越高表明相应蛋白表达越低。
2.3.4 Western blot 检测 Smad7 蛋白的表达取肾组织，按10 mg组织加入 100 μL RIPA 裂解液匀浆，裂解充分后13 000×g、4 ℃离心，取上清液，用 BCA法进行蛋白定量。取等量蛋白样本100 ℃加热 5 min，使蛋白变性，变性后的蛋白贮存于-20 ℃用于后续实验。取40 μg等量变性过的蛋白样本经电泳、转膜、封闭后，滴加兔抗 Smad7 抗体（1∶300
稀释），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，再加辣根过氧化
物酶标记的二抗（1∶2500 稀释），室温孵育 2h，TBST洗膜，ECL化学发光法曝光。以GAPDH作为内参照，通过计算目标蛋白与GAPDH蛋白的灰度比值进行半定量分析。
2.3.5 RT-PCR 检测 Smad7 mRNA的表达引物序列取自NCBI Nu-cleotide Database 数据库，经 Primer软件设计与检验，大连宝生物工程有限公司
合成。Smad7 上游：5'-AGAAGATATCCAGGGAGG
GCTCTT-3'，下游：5'-CGCTGTACCTTCCTCCGAT-3'，产物长度 182 bp；β-actin 上游：5'-GCCCCTGAGGA
GCACCCTGT-3'，下游：5'-ACGCTCGGTCAGGATCT
TCA-3'，产物长度 300 bp。取大鼠肾组织 30 mg，按总 RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒及扩增试剂盒说明书分别提取各组总RNA及反转录合成cDNA模板，取 2 μL cDNA 用于 RT-PCR。β-actin mRNA作为内参
照。反应条件：94 ℃、30 s，95 ℃、20 s，57 ℃、
30 s，72 ℃、60 s 45 个循环；95 ℃、30 s，60 ℃、
60 s，95 ℃、30 s。在每个循环延伸末收集荧光信号，绘制扩增曲线，检测各样本的阈值循环数（CT值），以 2-ΔΔCT法对目的基因进行相对定量分析。3 统计学方法
采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。实验数据用x±s — 表示，计量资料用方差分析，组间两两比较用LSD
法。P＜0.05表示差异有统计学意义。4 结果4.1 益气通阳方对模型大鼠血清肌酐和尿素氮的影响与假手术组比较，模型组大鼠血清SCr、BUN 明
显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，中药组和西药组大鼠血清 SCr、BUN 明显下降，
差异有统计学意义（P＜0.05）；中药组和西药组比较
差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。4.2益气通阳方对模型大鼠肾脏病理形态的影响
肉眼观察，假手术组大鼠梗阻侧肾脏外观正常，有光泽、呈红褐色，形态规则，质地柔韧；造模组大鼠梗阻侧肾脏体积不同程度增大，形态不规整，肾皮质变薄，有肾积水。HE和 Masson 染色结果显示，假手术组大鼠肾组织形态正常，肾小球和肾小管大小形态正常，肾小管排列整齐致密，未见肾小管扩张，肾间质可见少量蓝色的胶原纤维沉积；模型组大鼠梗阻侧肾脏可见部分肾小管上皮细胞空泡变性，部分管腔扩张，肾间质水肿和大量炎性细胞浸润，肾间质和肾小管出现大量蓝色的胶原纤维沉积；中药组和西药组大鼠梗阻侧肾脏炎性细胞浸润、肾小管扩张程度和间质胶原纤维沉积程度均较模型组减轻。见图1、图 2。
4.3 益气通阳方对模型大鼠肾组织转化生长因子-β1、纤维连接蛋白表达的影响
正常大鼠肾组织 TGF-β1 的表达主要在肾小管上皮细胞中，肾小球中基本没有表达，而FN的表达主要位于肾小球系膜区。假手术组大鼠 TGF-β1 和 FN表达较弱，着色浅淡；模型组大鼠 TGF-β1 和 FN 的表达较假手术组明显增强，呈棕褐色颗粒样沉积，着色较深，与假手术组比较差异有统计学意义（P＜
0.01）；与模型组比较，中药组和西药组大鼠 TGF-β1和 FN 蛋白表达明显降低（P＜0.05）；中药组和西药组 TGF-β1、FN 蛋白表达差异无统计学意义（P＞
0.05）。见表 2、图 3 和图4。
4.4 益气通阳方对模型大鼠肾组织 Smad7 蛋白和mRNA表达的影响
与假手术组比较，模型组大鼠 Smad7 蛋白和mRNA 表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，中药组和西药组大鼠 Smad7 蛋白和mRNA 表达明显升高，差异有统计学意义（ P＜
0.05）。见表 3、图 5。5 讨论多种病理因素（如氧化应激、组织炎症、成纤维细胞的异常增生与活化及多种细胞因子的大量释放）可导致 ECM 的合成与降解紊乱，最终引起纤维化的
产生[5]。既往研究表明，在 RIF过程中，大量释放的细胞因子 TGF-β1 能够促进 ECM 的合成与聚集，从
而加速纤维化的进程[6]。ECM的过度积聚主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及FN的沉积，而FN 是 ECM 的重要组成成分，是目前评价RIF 程度较常用的指标[7]。病理状态下，异常分泌的 TGF-β1 可通过多条途径推动纤维化的进展，而 Smads 信号蛋白是 TGF-β1 信号能否发挥作用的重要调节靶点。目前发现的 Smads成员有9个，按功能可分为活化型、共同通路型以及
抑制型三类[8]。Smad7 蛋白的正常表达可抑制异常激活的 TGF-β1/Smads 信号通路，而纤维化过程中，
Smad7 蛋白表达受到抑制则是 TGF-β1 下游通路过度
激活的重要原因之一[9]。本研究通过检测 TGF-β1 及
Smad7表达，对益气通阳方改善大鼠RIF 的可能机制进行探索。
RIF属中医学“癃闭”“肾劳”“肾风”“溺毒”等
范畴。本病病机为本虚标实[10]，主要以脾肾气虚、肾阳衰败为本，湿浊、瘀毒为标。经曰：“邪之所凑，其气必虚”；《医宗必读》谓：“气充于外，邪无所容耳”；叶天士又云：“大凡经主气，络主血，久病血瘀”。由于正气虚损，脾肾功能失调，气虚水湿不运，阳虚
气化不行，致使湿浊内蕴，日久化热，瘀毒留滞。本研究针对以上病机予以益气活血、通阳解毒之法，自拟益气通阳方治疗本病，以达到扶正固本、祛邪治标之效。黄芪为君补脾益气，臣以淫羊藿补肾助阳，二药为伍，补虚固本；红花活血化瘀，畅通血脉，与黄芪相配，一通一补，以奏气行血行之效；大黄泻热毒，破积滞，能入血分，破一切瘀血，推陈致新，土鳖虫破积滞、去血积，二药相伍，增强逐瘀泄浊之力；佐以白花蛇舌草清热解毒、利尿除湿，使邪有所出。全方通补兼施，标本兼顾。
本研究结果显示，益气通阳方能减轻肾脏功能损伤以及肾病理改变，使RIF程度明显减轻。与此同时，益气通阳方还能抑制 TGF-β1 的异常表达并上调Smad7 信号蛋白和 mRNA 表达。结果提示，益气通阳方可能通过抑制 TGF-β1 的过表达并解除病理因素对 Smad7蛋白的过度抑制而发挥抗RIF 作用。
综上，益气通阳方能延缓RIF进展，可能是通过上调Smad7信号蛋白并抑制过表达的TGF-β1蛋白发挥作用。
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