秦艽寒热不同配伍对风寒湿痹类风湿关节炎大鼠白细胞介素-6及血管内皮生长因子的影响

苏杉，王蓉，赵敏，吴晨，高慧琴

苏杉，王蓉，赵敏，吴晨，高慧琴甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

摘要：目的 观察秦艽不同配伍药对对风寒湿痹型类风湿关节炎（RA）模型大鼠白细胞介素-6（IL-6）及血管内皮生长因子（VEGF）的影响，从中药药性及复方配伍理论的角度揭示中药药性-病证-功效的关联性。方法 80 只 SD大鼠随机分为空白对照组、Ⅱ型胶原组、病证模型组、阳性对照组、单味秦艽组、秦威组（秦艽配伍威灵仙）、秦桑组（秦艽配伍桑寄生）、秦防组（秦艽配伍防己），每组10只。注射Ⅱ型胶原乳剂并施加风寒湿刺激制备风寒湿型RA大鼠模型。造模完成后各给药组给予相应药液，空白对照组、Ⅱ型胶原组及病证模型组给予生理盐水。实验过程中，记录大鼠一般状况；每3 d测量1次大鼠左后足跖厚度，并计算足跖肿胀度；实验第 38 日大鼠进行关节炎指数（AI）评分；ELISA 检测大鼠血清 IL-6 含量；Western blot 和 RT-PCR分别检测大鼠踝关节VEGF的蛋白和mRNA表达。结果 与空白组比较，Ⅱ型胶原组和病证模型组足跖肿胀度、AI评分、血清 IL-6 含量、踝关节VEGF 蛋白和mRNA 表达明显增加（P＜0.01）；与病证模型组比较，各中药组足跖肿胀度、AI 评分、血清 IL-6 含量、踝关节 VEGF 蛋白和 mRNA 表达均有所减少，其中秦威组最

明显（P＜0.01）。结论 对于风寒湿痹型RA，药性平温相配疗效优于平平相配、平寒相配及单味秦艽，实验结果与中医“疗寒以热药”的原则基本相符。

关键词：秦艽；风寒湿痹；类风湿关节炎；白细胞介素-6；血管内皮生长因子；大鼠

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)03-0039-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.03.010 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节病变为主要症状的慢性、全身性自身免疫疾病。其临床主要表现为局部关节疼痛、肿胀、晨僵、

关节软骨破坏、贫血等[1]，属中医学“痹证”范畴。本研究在中医理论指导下，通过前期对秦艽不同寒热

配伍的研究[2-4]及相关文献[5-8]，选温性祛风湿药威灵仙、平性祛风湿药桑寄生、寒性祛风湿药防己与平性祛风湿药秦艽组成平温相配、平平相配、平寒相配的配伍关系，观察秦艽寒热不同配伍药对对风寒湿痹 RA 模型大鼠血清白细胞介素-6（IL-6）及踝关节血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响，从中药药性及复方配伍理论角度揭示中药药性-病证-功效的关联性。

1 实验材料

1.1 动物

SPF 级SD大鼠80只，雌雄皆用，体质量（200±

20）g，甘肃中医药大学科研实验中心提供，动物许可证号SCXK（甘）2015-0002。饲养于温度24～26 ℃、相对湿度45%～65%环境，自由摄食饮水。

1.2 药物及制备秦艽、威灵仙、桑寄生、防己，饮片购自兰州惠仁堂大药房，甘肃中医药大学中药鉴定教研室李成义教授鉴定均为正品。中药药液均由甘肃中医药大学中药药剂实验室协助制备。单味秦艽组：称秦艽300 g，第 1 次加 10倍量水煎煮1 h，第 2 次加8倍量水煎煮

30 min，合并2次药液，浓缩至每毫升含原药材1.67 g。秦艽配伍组（秦威组、秦桑组、秦防组）按 1∶1 比例分别取秦艽和威灵仙、秦艽和桑寄生、秦艽和防己各 150 g，煎煮方法同上，药液制备完成后置于4 ℃冰箱贮存备用。雷公藤多苷片，远大医药黄石飞云制药有限公司，批号 20150501，将雷公藤多苷片碾成粉末状，加适量生理盐水，配制为0.4 mg/mL 雷公藤多苷混悬液，备用。

1.3 主要试剂与仪器天然牛Ⅱ型胶原，北京 Solarbio 公司，批号

908E052；完全弗氏佐剂，美国 Sigma 公司，批号

SLBS1330V；冰醋酸，天津市富宇精细化工有限公司，批号 20150110；IL-6 试剂盒，江苏菲亚生物科技有限公司，批号 MM-0190R1；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒，北京 Solarbio 公司，批号 20170915；GAPDH Polyclonal Antibody，Immunoway Biotechnology 公司，批号 B5201；Anti-VEGF antibody，美国 abcam 公司，批号 ab46154；HRP，Goat Anti-Rabbit IgG，美国Abbkine 公司，批号 A21020；SYBR® Green Realtime PCR Master Mix 扩增试剂盒，TOYOBO公司，批号

717000 ； ReverTra Ace® qPCR 反转录试剂盒， TOYOBO 公司，批号 711000；GAPDH 引物，生工生物工程（上海）股份有限公司，批号D829KA6434； VEGF-F，生工生物工程（上海）股份有限公司，批号 1408556120；VEGF-R，生工生物工程（上海）股份有限公司，批号 1408556127。改装后智能人工气候箱（气候箱中装3个风扇，控制风速为5 m/s），宁波江南仪器厂，型号 RXZ-380A-LED；酶标仪，美国BIO-RAD 公司，型号 Benchmark Plus；电泳仪，北京六一生物科技有限公司，型号 DYCZ-24DN；凝胶成像仪，美国 Azure Biosystems 公司，型号 C300；梯度PCR 仪，美国 BIO-RAD 公司，型号 S1000TM Thermal Cycler；实时荧光定量 PCR 仪，美国 ABI 公司，型号

7500。2 实验方法

2.1 分组

大鼠适应性喂养3 d，按随机数字表法将80 只大鼠分为空白对照组、Ⅱ型胶原组、病证模型组（Ⅱ型胶原＋风寒湿刺激）、阳性对照组、单味秦艽组、秦

威组、秦桑组、秦防组，共8组，每组 10 只。

2.2 胶原乳剂制备

精密吸取 0.3 mL冰醋酸置于50 mL容量瓶内，加入注射用水定容，得 0.1 mol/L 冰醋酸溶液。精密称量天然牛Ⅱ型胶原5 mg 置于 25 mL容量瓶内，置于冰水浴中，用配制好的冰醋酸溶液稀释、定容，得Ⅱ型胶原溶液，置于4 ℃冰箱保存过夜。注射当日，取 25 mL Ⅱ型胶原溶液与等体积完全弗氏佐剂在冰水浴中充分混匀乳化，得0.1 mg/mL 胶原乳剂。

2.3 造模

参考文献[3]方法，于实验第 1日，除空白组外其余组大鼠在背部两点（背部脊柱两侧）及尾根部一点，剃毛，皮内注射胶原乳剂0.1 mL，共 0.3 mL。第 12日大鼠左后足跖皮内注射 0.1 mL 胶原乳剂进行二次免疫，空白组在相同部位注射等体积注射用水。从初次注射胶原乳剂第2日开始，除空白组及Ⅱ型胶原组外，其余组大鼠均采用改装后的智能人工气候箱进行风寒湿痹型RA模型的造模。风寒湿环境条件：温度

4 ℃，风速5 m/s，相对湿度≥95%，风寒湿刺激时大鼠足跖没入0 ℃冰水混合液中。每日1 次，30 min/次，连续 18 d。

2.4 给药造模结束后，各中药组按25 g/kg 给予相应药液，阳性对照组按6 mg/kg给予雷公藤多苷混悬液，其余组给予等量生理盐水。每只大鼠给药 3 mL，每日

1次，连续21 d。

2.5 观察指标及方法

2.5.1 一般状况观察实验过程中进行大鼠一般状况观察。

2.5.2 足跖肿胀度游标卡尺测量大鼠左后足跖厚度，每 3 d 测量

1 次，计算大鼠足跖肿胀度。足跖肿胀度＝（致炎后足跖厚度－致炎前足跖厚度）÷致炎前足跖厚度。

2.5.3 关节炎指数评分

于实验第 38 日起分别对大鼠进行关节炎指数（AI）评分，采用5级评分法：正常、无关节炎症计

0分，足趾关节轻度发红或肿胀计1分，足趾或踝关节中度肿胀计2分，踝关节严重肿胀或踝关节以下全部肿胀计3分，整个足爪肿胀或关节严重变形、不能负重计4分。每只大鼠4只足爪评分之和作为最终的AI评分，每只大鼠最高不超过16 分。

2.5.4 大鼠血清白细胞介素-6检测大鼠末次给药1h后，股动脉取血5 mL，静置 2 h，

3000 r/min 离心 15 min，取血清，ELISA 试剂盒检测大鼠血清中IL-6含量，操作严格按试剂盒说明书进行。

2.5.5 Western blot检测血管内皮生长因子的蛋白表达大鼠踝关节部位，每组3只，提取踝关节蛋白样本，并检测蛋白浓度，将样本上样至 12%SDS-PAGE凝胶梳孔中，电泳，转膜，封闭，一抗 VEGF（1∶

899）中孵育，过夜后，洗膜，二抗孵育，洗膜，ECL发光显影，凝胶成像仪曝光，拍照，应用Image J 软件检测条带光密度值，目的条带光密度值与内参条带光密度值，得目的蛋白的相对表达量。

2.5.6 RT-PCR 检测血管内皮生长因子mRNA 表达取大鼠踝关节部位，每组3只，提取踝关节RNA样本。按照说明书运用 Trizol 法提取样本总RNA，微量紫外分光光度计检测样本RNA浓度，确保 OD260/280在 1.8～2.0 之间，再将RNA样本采用 ReverTra Ace® qPCR反转录试剂盒进行反转录，反应体系为50 μL，

具体步骤按说明书进行操作。反应参数设置为：37 ℃、

15 min，98 ℃、5 min，然后-20 ℃保存。GAPDH 为内参，采用 SYBR® Green Realtime PCR Master Mix扩增试剂盒，反应体系为20 μL，具体步骤按说明书操作。引物1 μL：VEGF 上游 5'-TCGGAGAGCAAC

GTCACTATG-3', 下游 5'-TGGTCTGCATTCACATC

TGC-3'，产物长度 40 bp。反应参数：95 ℃、60 s，

95℃、15 s，60 ℃、60 s，融解曲线分析，共40个循环。3 统计学方法

采用 SPSS 21.0统计软件进行分析。计量资料服从正态分布时以x±s — 表示，多组间数据比较用方差分

析，两两比较用LSD 法。P＜0.05 表示差异有统计学

意义。4 结果4.1 一般状况实验过程中，空白组大鼠较活跃，毛发洁白柔顺，二便正常，体质量增加快。造模组大鼠初次免疫后活动减少，毛发蓬松、色微黄，左后足跖略红肿，二便正常，体质量增加较缓慢；二次加强免疫后 2 h，造模组大鼠活动明显减少，喜侧卧，左后足跖肿胀明显，行走困难，二便正常；加强免疫后第2日，左后足跖肿胀，皮肤触之柔软，呈紫红色，发热明显；加强免疫后第3日，个别大鼠左后足跖出现蜕皮现象；加强免疫后第4日，个别大鼠出现四肢肿胀；二次免疫过程中，大鼠体质量增加缓慢。治疗第2日，足跖肿胀均不同程度减小；治疗第6日，大鼠活动增加；治疗阶段，各给药组左后足跖颜色由紫红色变深红色至淡红色，多数最后恢复为肤色，体质量增加稍快，行走较自如。Ⅱ型胶原组及病证模型组未见明显恢复。

4.2秦艽不同配伍药对对大鼠足跖肿胀度的影响实验第 18 日，与空白组比较，造模组大鼠足跖

肿胀度明显升高（P＜0.01）；实验第 36 日，与病证模型组比较，各给药组大鼠足跖肿胀度均明显降低

（P＜0.05，P＜0.01），其中秦威组最明显，且秦威组

肿胀度明显低于秦防组（P＜0.05）。结果见表1。

4.3 秦艽不同配伍药对对大鼠关节炎指数评分的影响

与空白组比较，Ⅱ型胶原组和病证模型组大鼠AI 评分显著升高（P＜0.01），且病证模型组 AI 评分

明显高于Ⅱ型胶原组（P＜0.01）；与Ⅱ型胶原组及病证模型组比较，各给药组大鼠 AI 评分明显降低，差

4.5 秦艽不同配伍药对对大鼠踝关节血管内皮生长因子蛋白表达的影响

与空白组比较，Ⅱ型胶原组与病证模型组大鼠VEGF蛋白表达明显升高（P＜0.01），且病证模型

组高于Ⅱ型胶原组（P＜0.05）；与Ⅱ型胶原组比较，阳性对照组、秦威组、秦防组大鼠VEGF 蛋白表达

均明显降低（P＜0.01）；与病证模型组比较，阳性对

异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；各中药给药组间比较，秦威组大鼠 AI 评分明显低于秦防组（P＜

0.05）。结果见表 1。

4.4 秦艽不同配伍药对对大鼠血清白细胞介素-6 含量的影响

与空白组比较，Ⅱ型胶原组及病证模型组大鼠血清 IL-6 含量明显升高（P＜0.01）；与Ⅱ型胶原组比较，阳性对照组、单味秦艽组、秦威组大鼠血清IL-6 含量

明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与病证模型组比较，各给药组大鼠血清IL-6 含量均明

显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），其中秦威组血清 IL-6 含量最低。结果见表2。

—照组、秦威组、秦桑组和秦防组大鼠VEGF 蛋白表

达均明显降低（P＜0.01）；各给药组间比较，阳性对照组、秦威组及秦防组大鼠 VEGF 蛋白表达明显

低于单味秦艽组及秦桑组（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表3、图 1。

0.01；与病证模型组比较，▲▲P＜0.01；与阳性对照组比较，■■P＜

0.01；与单味秦艽组比较，※※P＜0.01；与秦威组比较，★P＜

0.05；与秦桑组比较，●P＜0.05

4.6 秦艽不同配伍药对对大鼠踝关节血管内皮生长因子 mRNA表达的影响

与空白组比较，Ⅱ型胶原组与病证模型组大鼠VEGF mRNA 表达明显升高（P＜0.01）；与Ⅱ型胶原组及病证模型组比较，阳性对照组、单味秦艽组、秦威组、秦桑组大鼠VEGF mRNA表达明显降低（P＜

0.05，P＜0.01）；各给药组间比较，单味秦艽组大鼠VEGF mRNA 表达明显高于阳性对照组（P＜0.01）；秦威组大鼠 VEGF mRNA 表达明显高于阳性对照组

（P＜0.01），而低于单味秦艽组（P＜0.01）；秦桑组大鼠 VEGF mRNA表达明显高于阳性对照组、单味秦

艽组及秦威组（P＜0.01）；秦防组大鼠 VEGF mRNA表达明显高于阳性对照组、单味秦艽组、秦威组及秦

桑组（P＜0.01）。见表 4。5 讨论

RA 不仅侵犯关节滑膜、软骨、韧带和肌肉，还

可能影响心、肺等脏器功能[9]。IL-6 是一种具有多种生物活性的细胞因子，主要由巨噬细胞、树突细胞、B 细胞、T 细胞、成骨细胞、肿瘤细胞等分泌产生[10-11]，

可介导炎症反应和免疫反应等[12]，在许多炎性疾病中表达量高，如 RA、系统性红斑狼疮等[13-14]。IL-6 不仅参与关节破坏和炎症发生，还可参与RA多系统损害，RA 患者出现关节滑膜、软骨破坏的局部症状及贫血、疲劳、低热等全身症状均与IL-6 相关，且全身症状的周期性和 IL-6 周期性相关。IL-6 及 IL-6 受体

（IL-6R）水平与 RA患者的类风湿因子（RF）、红细胞沉降率、C 反应蛋白（CRP）及临床表现相关[12]。因此抑制IL-6 及 IL-6R水平能够改善RA患者的关节

症状，控制病情的发展。IL-6可提高 VEGF 的水平，促进炎性细胞渗出，提高关节血管通透性，加重关节炎症及血管翳的形成，血管翳具有类似于肿瘤组织侵蚀的作用，可引起关节软骨破坏，对RA的发生及发

展起重要作用[15-16]。VEGF 是 RA血管新生的重要因

子，主要由成纤维细胞及中性粒细胞等分泌[17]。研究显示，VEGF 在 RA患者关节滑膜处高表达，随着病情发展，VEGF 含量升高，且与 RF 含量、红细胞沉降率及 CRP 等呈正相关，可作为诊断 RA 患者关

节损害和预后的重要指标[18]。VEGF 抑制剂对于血管新生有特异性的抑制作用，可明显改善 RA 病

情[19]。本实验结果显示，与空白组比较，Ⅱ型胶原组及病证模型组足跖肿胀度、AI 评分、IL-6 含量、踝关节 VEGF 蛋白相对表达量及踝关节 VEGF mRNA 相对表达量明显升高（P＜0.01），且病证模型组高于Ⅱ型胶原组，提示Ⅱ型胶原诱导加风寒湿刺激模型比单纯Ⅱ型胶原模型病情严重，造模基本成功。经药物治疗后，各给药组足跖肿胀度、AI评分、IL-6 含量、踝关节VEGF蛋白及mRNA表达均有不同程度降低，其中秦威组及阳性对照组降低最明显，优于单味秦艽组、秦桑组及秦防组。

综上所述，药性平温相配的秦威组改善风寒湿痹RA 的效果优于平平相配的秦桑组、平寒相配的秦防组及平性单味秦艽组，其机制可能与其降低血清IL-6含量及踝关节VEGF表达水平，减轻关节软骨破坏及血管翳形成有关。提示对于寒性病证，应给予热性药物治疗会取得更好的治疗效果，与中医“疗寒以热药”治疗原则相符。

参考文献：

[1] 于天一,孔庆喜,陈丽姝,等.类风湿关节炎的病理机制浅析[J].黑龙

江医药,2014,27(1)：98-102.

[2] SZEKANECZ Z,KOCH A E. Targeting an giogenesis in rheumatoid arthritis[J]. Curr Rheumatol Rev,2008,4(4)：298-303.

[3] 高慧琴,吴国泰,孙少伯,等.秦艽不同配伍对风湿痹证模型大鼠血清

炎症因子水平的影响[J].中医杂志,2013,54(9)：785-788.

[4] 高慧琴,吴国泰.秦艽不同配伍的抗炎镇痛作用[J].中国实验方剂学

杂志,2010,16(9)：182-183.

[5] 程仕萍,贾冬梅,周平生,等.基于文本挖掘的中医药治疗类风湿关节

炎骨破坏用药规律[J].中医杂志,2016,57(11)：970-974.

[6] 王颖,郑炜,刘小平,等.基于中医传承辅助平台的中医药治疗类风湿

关节炎用药规律分析[J].中国实验方剂学杂志,2016,22(23)：181-186.

[7] 柳春,梁永林,姚柳伊.类风湿关节炎寒湿痹阻证用药规律研究[J].中

国中西医结合杂志,2013,33(9)：1269-1272.

[8] 赵建萍,赵秀娟,陈谢谢,等.中药治疗类风湿关节炎的常用药分析[J].

医药论坛杂志,2017,38(9)：5-7.

[9] 张华东.对类风湿关节炎发病机制的认识[N].中国中医药报,

2003-03-03(03).

[10] DIENZ O, EATON S J, NEVEU W, et al.The induction of antibody production by IL-6 is indirectly mediated by IL-21 produced by

CD4+T cells[J]. Journal of Experimental Medicine,2009,206：69-78.

[11] YOUINOU P, JAMIN C. The weight of interleukin-6 in B cell-related autoimmune disorders[J]. Journal of Autoimmunity,

2009,32(3/4)：206.

[12] 苗平,陆梅生,张冬青.IL-6/IL-6 受体与类风湿关节炎关联性研究新

进展[J].免疫学杂志,2011,27(4)：355-360.

[13] 毛丹青,朱爱玲,童巧薇,等.妊娠高血压疾病患者治疗前后血清白介

素-6、8、10 水平的变化[J].中国现代医生,2013,51(28)：40-41. [14] 赵璐.IL-6/STAT3 信号传导通路及其在肿瘤靶向治疗的研究进展[J].

中外医学研究,2012,10(14)：144-146.

[15] 储永良,黄清春.血管内皮生长因子及其受体对类风湿关节炎新生血

管的影响[J].中国组织工程研究,2005,9(39)：142-144.

[16] 黄佩琼,李龙.类风湿关节炎发病期间血管内皮生长因子与白介素的

作用研究进展[J].中外医学研究,2016,14(33)：156-157.

[17] 陈勇,黄娴倩,陈立斌,等.类风湿关节炎患者超声评估滑膜病变与血

清血管内皮生长因子检测的相关性研究[J].现代实用医学,2011,23(9)：

973-976.

[18] LEE S S, JOO Y S, KIM W U, et al. Vascular endothelial growth factor levels in the serum and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis[J]. Clinical & Experimental Rheumatology,

2001,19(3)：321-324.

[19] BANDT M D, MAHDI M H B, OLLIVIER V, et al. Blockade of vascular endothelial growth factor receptor Ⅰ (VEGF-RⅠ),but not VEGF-RⅡ, suppresses joint destruction in the K/BxN model of rheumatoid arthritis[J]. Journal of Immunology,2003,171(9)：4853-4859.