CJI (Traditional Chinese Medicine)
淫羊藿黄酮类成分指纹图谱研究
牛晓静,鲁静,段晓颖,徐立然
河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450008
摘要:目的 建立淫羊藿中黄酮类成分HPLC指纹图谱。方法 采用 Agilent ZORBAX Eclispse SB-C18
色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 µm),以乙腈(A)-水(B)为流动相,梯度洗脱(0~8 min,15%→25%A;8~
25 min,25%A;25~32 min,25%→33%A,32~48 min,33%→38%A;48~60 min,38%→60%A;60~70 min,
60%→85%A;70~75 min,15%A),流速 1.0 mL/min,柱温 30 ℃,检测波长为270 nm,进样量 10 µL。对
11批淫羊藿指纹图谱进行相似度分析及方法学考察。结果 11批淫羊藿药材有21个共有峰,相似度为 0.845~
0.952,对 5 个色谱峰进行了归属;方法学考察结果表明,建立的分析方法重复性、精密度、稳定性良好;相
似度分析将11批淫羊藿分为4大类,与淫羊藿物种鉴定结果一致。结论 不同产地淫羊藿有一定的相似性, HPLC指纹图谱能够为淫羊藿的物种鉴定及内在质量评价提供依据。关键词:淫羊藿;黄酮类成分;指纹图谱;高效液相色谱法中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2019)03-0088-05 DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2019.03.019 开放科学(资源服务)标识码(OSID):淫羊藿为小檗科植物淫羊藿 Epimedium brevicornu Maxim.、箭叶淫羊藿 Epimedium sagittatum ( Sieb.et Zucc. ) Maxim.、柔毛淫羊藿 Epimedium pubescens Maxim.或朝鲜淫羊藿 Epimedium koreanum Nakai的干燥叶,夏、秋季莲叶茂盛时采收,晒干或
阴干[1]。产地多集中在中国东北、西北、华东、西南
及山西、河南等[2],由于不同品种在形态特征、生境特征、居群大小、繁殖方式、资源利用状况和地方土名等方面的差异,物种鉴定尚存在诸多疑问[3-4]。指纹图谱是基于对中药物质群整体作用的认识,借助波谱和色谱等技术获得中药化学成分的光谱或色谱图,是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式,具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点,能对中药内在质量进行有效表征、综
合评价和全面控制[5]。本课题组采用指纹图谱方法对淫羊藿黄酮类成分进行分析,并对5种黄酮类成分进行归属,为淫羊藿的物种归属和鉴定提供一定依据。
1 仪器与试药Waters e2695型高效液相色谱仪(美国沃特世公司),Waters 2998型紫外检测器(美国沃特世公司), TU-1800PC型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),CP225D 型电子天平(德国赛多利斯集团),BSA224S-CW 型电子天平(德国赛多利斯集团)。11批淫羊藿编号为S1~S11,依次为箭叶淫羊藿
(20140217-1,东北吉林)、淫羊藿(130716,甘肃
陇南)、柔毛淫羊藿(20140303,四川)、箭叶淫羊藿
(20140303-2,甘肃)、淫羊藿(130107,甘肃阳县)、
箭叶淫羊藿( 20140303-1 ,甘肃)、朝鲜淫羊藿
(20140217-2,东北吉林)、淫羊藿(20140303,陕
西)、箭叶淫羊藿(140301,甘肃陇南)、朝鲜淫羊藿
(131107,辽宁辽阳)、朝鲜淫羊藿(131015,吉林
通化),经本院陈天朝主任药师鉴定,符合2015 年版《中华人民共和国药典》(一部)规定。淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品(批号分别为 110737-200415、111852201102),中国食品药品检定研究院;朝藿定A、朝藿定 B、朝藿定 C(批号分别为 130520、130518、
130601),成都普菲德生物技术有限公司;甲醇、乙腈均为色谱纯,水为高纯水,其他试剂均为分析纯。2 方法与结果
2.1 色谱条件采用 Agilent ZORBAX Eclispse SB-C18 色谱柱
(4.6 mm×150 mm,5 µm),以乙腈(A)-水(B)
为流动相,梯度洗脱(0~8 min,15%→25%A;8~
25 min,25%A;25~32 min,25%→33%A;32~48 min,
33%→38%A;48~60 min,38%→60%A;60~70 min,
60%→85%A;70~75 min,15%A),流速 1.0 mL/min,
柱温 30 ℃,检测波长 270 nm,进样量 10 µL。理论
板数按淫羊藿苷峰计算应均不低于5000。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品,精密称定,加甲醇溶解稀释,制成混合对照品溶液,浓度分别为朝藿定A 48.84 µg/mL、朝藿定B 95.2 µg/mL、朝藿定 C 0.1031 mg/mL、淫羊
藿苷 52.5 µg/mL、宝藿苷Ⅰ6.475 µg/mL。
2.2.2 供试品溶液的制备取本品粉末(过3号筛)约 0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入稀乙醇20 mL,称定质量,超声处理(功率250 W,频率 40 kHz)1h,再称定质量,用稀乙醇补足减失的质量,摇匀,过滤,取续滤液,即得。进样前用0.45 µm微孔滤膜过滤。2.3 指纹图谱方法学考察
2.3.1 精密度试验取淫羊藿样品(批号 130716),按“2.2.2”项下
方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样分析,连续测定6次,记录色谱图。以参照峰的保留时间和峰面积为参比,结果供试品溶液中各共有峰相对保留时间的 RSD 为 0.04%~0.971%,相对峰面积的
RSD 为 0.15%~2.97%,表明该方法精密度好。
2.3.2 重复性试验取淫羊藿样品(批号 130716),按“2.2.2”项下
方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样分析。结果供试品溶液中各共有峰相对保留时间的RSD为 0.13%~1.48%,相对峰面积的 RSD 为 0.56%~
3.20%,表明该方法重复性良好。2.3.3 稳定性试验取淫羊藿样品(批号 130716),按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,分别于室温放置0、2、4、8、
12、24 h,按“2.1”项下色谱条件进样分析。结果24 h内供试品溶液中各共有峰相对保留时间的 RSD 为0.19% ~ 3.38% ,相对峰面积的 RSD 为 0.526% ~ 2.65%,表明供试品溶液在 24 h内稳定。2.3.4 专属性试验精密吸取空白溶液10 µL,注入色谱仪,按规定的梯度条件洗脱,结果表明阴性对照无干扰。2.4 样品测定
取 11 批淫羊藿样品(见表 1),按“2.2.2”项下
方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图,结果见图1。
2.5 特征指纹图谱的建立
2.5.1 参照峰的选择在各批样品指纹图谱中,淫羊藿苷的保留时间居中,分离度良好,且为淫羊藿的主要黄酮类成分之一,故确定 13号峰淫羊藿苷为参照峰(S)。2.5.2 特征指纹图谱的建立及相似度评价
将 11 批淫羊藿色谱图数据导入国家药典委员会
《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)》进行自动匹配,以淫羊藿共有模式图谱为标准,进行整体
相似度评价,11批淫羊藿的相似度为 0.845~0.952,同时确定了 21 个共有峰,根据对照品保留时间与紫外光谱图指认了其中 10、11、12、13、20 号峰分别为朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝藿
苷Ⅰ,共有模式见图2,混合对照品 HPLC 图见图3。
11 批淫羊藿指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积见表1、表2,相似度评价结果见表3。
对各批淫羊藿指纹图谱进行直观分析可见,保留时间 52 min之前的色谱峰有良好的相似度;保留时间在 52~75 min 之间的极性相对较小的成分各批次之
间有较大差异,其中,S1~S9号各色谱图比较相似,与 S10、S11 号色谱图有较大差异。根据相似度评价可以看出,不同产地、批次的淫羊藿有一定的相似性,但也存在一定的差异,各共有峰峰面积差异较大,黄
酮类成分含量有较大差异。S2、S5、S8 相似度在
0.990~0.995,S7、S10、S11 相似度在 0.990~0.995,
S1、S4、S6、S9 相似度在 0.952~0.971。这 3类相似度较高的样品分别为淫羊霍、朝鲜淫羊藿、箭叶淫羊藿,与淫羊藿物种鉴定结果一致,而 S3 与其他批次有差异,为柔毛淫羊藿。1
3 讨论指纹图谱在中药质量的综合评价和控制方面有很大的发展,在化学指纹图谱、生物指纹图谱和代谢指纹图谱等技术方面都有突破性的进展。除用于考察中药材的归属、鉴别[6-10],以提供生产前原料药材真伪优劣的鉴别依据,更可用于中药生产过程的质量控
制,追踪制剂中某些化学成分的变化,监测原料药材与成品之间、成品各批次间质量的一致性及稳定性[11-14]。
淫羊藿因物种来源不同,质量有差异,某些产地样品相似度不好,这给进一步对淫羊藿进行药效学研究带来极大不便。本研究建立了淫羊藿中黄酮类成分
的指纹图谱方法,并对其中5个成分进行指认,方法简便快捷、精密度、重复性良好,结果表明能够客观
反映各共有峰所代表的化学成分含量高低,11批样品相似度为 0.845~0.952。不同产地、批次的淫羊藿有一定的相似性,但也存在一定的差异,指纹图谱能够为淫羊藿的物种鉴定及内在质量评价提供依据,更能反映出淫羊藿各有效成分含量的综合差异。
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