片仔癀对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠肝功能及核因子-κB蛋白表达的影响

2019-04-15 -

郑海音1，华丽萍2，张玉琴2，王晓颖2，徐伟 2

1.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州 350122；2.福建中医药大学药学院，福建福州 350122摘要：目的观察片仔癀对 CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝功能和核因子-κB（NF-κB）蛋白表达的影响，探讨其作用机制。方法将 24只大鼠随机分为正常对照组、模型组、片仔癀组、秋水仙碱组，每组6 只，50%CCl4灌胃8周制备肝纤维化模型。末次给药1 h后，血清测定ALT、AST、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白和透明质酸含量，取肝脏计算肝指数，HE染色和 VG 染色观察肝组织病理形态，Western blot 检测 NF-κB 蛋白表达。结果与正常对照组比较，模型组大鼠肝指数及ALT、AST、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、透明质酸含量和 NF-κB 蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠肝指数及 ALT、AST、

Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、透明质酸含量和 NF-κB 蛋白表达均明显降低（P＜0.01）。结论片仔癀对 CCl4所致肝纤维化大鼠具有保护作用，其机制可能与抑制NF-κB 的表达有关。关键词：片仔癀；肝纤维化；核因子-κB；大鼠

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)04-0057-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.04.013 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Pien Tze Huang on Liver Function and Nuclear Factor-κB Protein Expression in Rats with Hepatic Fibrosis Induced by Carbon Tetrachloride

ZHENG Haiyin1, HUA Liping2, ZHANG Yuqin2, WANG Xiaoying2, XU Wei2

1. College of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China

2. Pharmacy College, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China Abstract: Objective To investigate the protective effects of Pien Tze Huang on liver function and NF-κB protein expression in rats with hepatic fibrosis induced by CCl4; To discuss its mechanism of action. Methods Totally 24 rats were randomly divided into four groups: normal group, model group, PienTze Huang group and colchicine group, with 6 rats in each group. The liver fibrosis model was prepared by intragastric administration of 50% CCl4 for

8 weeks. After 1 hour of the last administration, serum was used to determine the contents of ALT, AST, type Ⅲ procollagen, type Ⅳ collagen, laminin and hyaluronic acid. Liver was taken to calculate the liver index. HE and VG staining were performed to observe the pathological damage. The expression level of NF-κB protein was determined by Western blot. Results Compared with the normal group, the levels of liver index, ALT, AST, type Ⅲ procollagen, type Ⅳ collagen, laminin, hyaluronic acid and NF-κB protein in the model group significantly increased (P<0.01). Compared with the model group, the liver index , ALT, AST, type Ⅲ procollagen, type Ⅳ collagen, laminin, hyaluronic acid and NF-κB protein significantly decreased in each administration group (P<0.01, P<0.05). Conclusion Pien Tze Huang has a significant protective effect on hepatic fibrosis induced by CCl4, which may be related to the inhibition of NF-κB expression.

Keywords: Pien Tze Huang; hepatic fibrosis; NF-κB; rats肝纤维化是由多种原因引起的慢性肝损伤所致的病理改变，以过度的细胞外基质（ECM）沉积和纤基金项目：国家自然科学基金（81503513）；福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划（NCETFJ）维状结构为特征，纤维疤痕破坏正常肝结构而影响肝

功能最后导致肝衰竭[1-2]。肝纤维化的进展往往与肝

硬化及肝癌有关[3-4]。肝纤维化虽可逆，但由于对病因及发病机制缺乏全面深入了解，至今临床上未有上

市的抗肝纤维化药物[5]。近年来，中药复方在干预肝

纤维化方面作用显著[6-7]。片仔癀由三七、麝香、牛

黄、蛇胆等中药组成[8]，有散瘀止血、消肿定痛的功效。有研究表明，片仔癀对肝纤维化和慢性肝损伤有

一定的保护作用[9-11]。因此，本研究在上述基础上，观察片仔癀对 CCl4 诱导的肝纤维化大鼠肝功能和核因子-κB（NF-κB）蛋白表达的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠 24 只，体质量（250±20）g，福建中医药大学动物实验中心，动物许可证号SCXK

（沪）2017-0005。饲养于福建中医药大学动物实验中心SPF级动物房，温度21～23 ℃，相对湿度55%～

75%，12 h昼夜循环。适应性饲养5 d后用于实验。

1.2 药物片仔癀，漳州片仔癀药业公司，批号 1703024；秋水仙碱片，西双版纳药业有限公司，批号170306。

1.3 主要试剂与仪器

CCl4 ，国药集团化学试剂有限公司，批号

20151109；花生油，鲁花集团，批号 20170325；水合氯醛，源叶生物科技有限公司，批号 Z03D6Y7011；细胞裂解液、PMSF，碧云天生物技术有限公司，批号 P00013B、ST506；ALT、AST 试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号 20180117、20180118；大鼠透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原肽 C端、Ⅳ型胶原 ELISA 试剂盒，上海西塘生物技术有限公司，批号分别为 1803201、1804202、1803202、

1804162。台式冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司），多功能酶标仪（奥地利 Infinite 公司），光学显微镜（德国 LEICA 公司），Mini-protean 3型垂直电泳槽（美国Bio-Rad 公司），ChemiDoc XRS＋凝胶成像分析系统（美国 Bio-Rad 公司）。

2 实验方法

2.1 造模及给药

根据文献[12]及预实验确定造模方法和给药剂量。大鼠随机分为正常对照组、模型组、片仔癀组、秋水仙碱组，每组6只。除正常对照组外，其余3组均给予 CCl4花生油（1∶1）1 mL/kg 灌胃，每周2次，共

8 周。造模同时，片仔癀组和秋水仙碱组予相应药物灌胃。除正常对照组外，均予高脂饲料。片仔癀给药量为 0.15 g/100 g，秋水仙碱给药量为 0.1 mg/100 g。给药体积 0.5 mL/100 g，1 次/d，连续 8周。

2.2 取材实验期间每周大鼠称重2次。末次给药前，禁食不禁水 24 h。取材前，10%水合氯醛 0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主动脉取血。取血完成后，立即解剖取肝脏，用于HE染色和 Western blot 检测。

2.3 肝脏检测称取肝脏质量，计算肝指数。肝指数（%）＝

肝脏湿重÷体质量×100%，随后用相机对每组大鼠肝脏同一条件进行拍照，观察肝脏形态。

2.4 HE 染色

取同一部位 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm肝组织，4%多聚甲醛浸泡，固定24 h，石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱二甲苯，水洗，HE染色 15 min，水洗，

1%盐酸乙醇镜检分化，乙醇脱水，中性树胶封固。

2.5 VG染色

4%多聚甲醛固定肝组织，石蜡切片，常规脱蜡

至水，95%乙醇稍洗，盐酸乙醇分化，VG染色 12 min，

95%乙醇分化脱水，二甲苯透明，中性树胶封固镜检。

2.6 血清指标检测将血离心获得血清，用ALT、AST 试剂盒和大鼠HA、LN、Ⅲ型前胶原肽C端免疫检测试剂盒、Ⅳ型胶原 ELISA定量检测试剂盒进行测定。

2.7 Western blot 检测

取肝组织，4 ℃冰浴，以 1∶10 比例（0.1 g 肝组

织∶1 mL裂解液）加入裂解液彻底研磨，12 000 r/min，离心 5 min，取上清液，用 BCA试剂盒进行蛋白含量的测定，按一定比例加入 5×loading Dye，100 ℃变性 10 min 后，上样，电泳，PVDF 转膜，5%脱脂奶粉封闭 2 h，TBST 清洗 3 次×10 min，孵育一抗（NF-κB 1∶1000），4 ℃摇床过夜。第 2 日，TBST清洗 3 次×10 min，孵育二抗（1∶5000）2 h，TBST清洗，显影。以GAPDH为内参，用 Image Lab 计算光密度值。

3 统计学方法

采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s — 表示，组间比较用方差分析。P＜0.05表示差异有

统计学意义。

4 结果4.1 片仔癀对肝纤维化大鼠体质量的影响在实验8周内，正常对照组大鼠体质量匀速增长，精神状态良好；模型组第1次造模后均出现较大幅度体质量持续降低，且精神低迷，活动力下降，持续约2 周，第 3周起，各组体质量持平并开始增加，但增幅与正常对照组相比较迟缓，活动力得到一定好转但明显迟缓于正常对照组；各给药组大鼠精神状态及毛发亮泽均有一定程度的好转。见表1。

4.2片仔癀对模型大鼠肝脏形态的影响

正常对照组大鼠肝脏颜色红润，表面光滑，质地柔软；模型组大鼠肝脏明显肿大，呈黄褐色，表面粗糙呈颗粒状；片仔癀组和秋水仙碱组大鼠较模型组肝脏肿大均有一定程度的降低，表面光滑及颜色有一定好转，更接近正常对照组大鼠肝脏形态。见图1。

4.3片仔癀对模型大鼠肝指数的影响与正常对照组比较，模型组大鼠肝指数显著升

高（P＜0.01）；与模型组比较，片仔癀组和秋水仙碱

组大鼠肝指数均显著降低（P＜0.01）。见图2。

0正常对照组模型组片仔癀组秋水仙碱组

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01

图 2 各组大鼠肝指数比较（x±s，每组— 6只）

4.4片仔癀对模型大鼠肝组织病理形态的影响

HE 染色结果显示，正常对照组大鼠肝组织形态正常；模型组大鼠肝细胞大量脂肪变性，炎性细胞浸润，大量纤维结缔组织增生，正常肝小叶结构被破坏，甚至出现肝小叶结构重新构建；片仔癀组和秋水仙碱组大鼠肝细胞脂肪变性明显减少，炎性细胞水平显著降低，纤维增生程度明显减轻，但未恢复至空白对照组的正常水平。VG染色结果显示，胶原纤维深粉色，与正常对照组比较，模型组大鼠胶原纤维明显增多，肝小叶结构受到破坏，各给药组大鼠肝纤维化呈现一定程度的好转。见图3。

4.5片仔癀对模型大鼠血清相关因子的影响与正常对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST、Ⅳ型胶原、Ⅲ型前胶原、HA 和 LN 均显著升高

（P＜0.01）；与模型组比较，片仔癀组和秋水仙碱组大鼠血清 ALT、AST、Ⅳ胶原、Ⅲ型前胶原、HA 和LN 均显著降低（P＜0.01）。见图 4～图 6。

4.6片仔癀对模型大鼠核因子-κB蛋白表达的影响与正常对照组比较，模型组大鼠肝组织 NF-κB

蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，片仔癀组和秋水仙碱组大鼠肝组织 NF-κB 蛋白表达明显

降低（P＜0.01）。见图 7。注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01图 7 各组大鼠肝组织 NF-κB 蛋白表达比较（x±s，每组— 6只） 5 讨论肝纤维化是多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，表现为肝内 ECM 过度异常地沉积，并影响肝脏的功能。肝纤维化最终会导致终末期肝硬化和肝细胞癌，同时严重影响患者的生活质量。CCl4诱导的肝纤维化模型是现阶段最为常见的肝纤维化模型。本实验以 CCl4 构建肝纤维化大鼠模型为基础，进行其作用及机制研究。结果表明，模型组大鼠肝脏出现不同程度肿大，血清 ALT、AST、HA、LN、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原等指标明显升高，表明模型大鼠肝功能遭到严重的损伤以及纤维化，而给予片仔癀治疗后，这些指标明显改善，说明片仔癀对肝纤维化有较好的保护作用。

NF-κB是一种多功能的核转录因子，几乎存在于所有细胞中，它调控多种细胞因子的表达，从而调节多种生理病理过程，如炎症、细胞凋亡等，在肝脏炎症、肝纤维化及肝细胞再生中都担任重要的角色。它以同构或异构二聚体形式存在，其中p65 和 p50 是普遍存在的异源二聚体，控制着大多数NF-κB 上调基因的表达。近年来大量实验表明，NF-κB参与肝纤维化的增殖与凋亡，它上调肿瘤坏死因子-α，诱导肝星状细胞的活化，从而引起肝纤维化[9-10]。本实验结果显示，模型组大鼠 NF-κB表达量显著升高，片仔癀干预可显著降低大鼠肝组织NF-κB 的蛋白表达。

综上，片仔癀可明显降低肝纤维化大鼠肝脏NF-κB的表达，起到抗肝纤维化的作用。目前临床上尚缺乏确实有效的药物，特异性抗肝纤维化的药物研发还处于初始阶段，加快中药抗肝纤维化的研究进程十分必要。

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