人参三七川芎提取物对高糖高脂诱导的衰老血管内皮细胞自噬的影响

王雪1，方靖漪2，杨静1，修成奎1，雷燕 1

1.中医药防治重大疾病基础研究北京市重点实验室，中国中医科学院医学实验中心，北京 100700；

2.广东药科大学中医药研究院广东省代谢性疾病中西医结合研究中心，广东 广州 510006摘要：目的 观察人参三七川芎提取物对血管内皮细胞自噬流的影响，探讨其延缓高糖高脂诱导血管内皮细胞衰老的作用机制。方法 采用 40 mmol/L 葡萄糖和 100 μmol/L棕榈酸钠造模，实验分为空白对照组、衰

老模型组和中药组（200 mg/L），干预 48 h。采用 CCK-8检测细胞增殖能力；β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老程度；Western blot 检测细胞 p16、p21、微管相关蛋白 1 轻链 3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）和 p62蛋白表达；免疫荧光检测自噬流变化。结果 与空白对照组比较，衰老模型组细胞增殖能力和LC3B-Ⅱ表达降低，β-半乳糖苷酶蓝染细胞数量和 p16、p21、p62蛋白表达增加，并存在自噬流阻滞；与衰老模型组比较，中药组细胞增殖能力增强，

LC3B-Ⅱ表达升高，β-半乳糖苷酶蓝染细胞数量减少，p16、p21 和 p62表达降低，自噬流畅通。结论 人参三七川芎提取物可延缓高糖高脂引起的血管内皮细胞衰老，其机制可能与增强细胞自噬活性有关。关键词：人参三七川芎提取物；血管内皮细胞；细胞衰老；自噬

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)04-0052-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.04.012 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Extracts of Ginseng Radix et Rhizoma, Notoginseng Radix et Rhizoma and Chuanxiong Rhizoma on Autophagy of High Glucose and High Fat-induced Senescence Vascular Endothelial Cells

WANG Xue1, FANG Jingyi2, YANG Jing1, XIU Chengkui1, LEI Yan1

1. Beijing Key Laboratory of Research of Chinese Medicine on Prevention and Treatment for Major Diseases, Medical Experiment Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China; 2. Chinese Medicine Research Institute of Guangdong Pharmaceutical University, Guangdong Research Center for Integrative

Medicine in Metabolic Diseases, Guangzhou 510006, China

Abstract: Objective To explore the effects of extracts of Ginseng Radix et Rhizoma, Notoginseng Radix et Rhizoma and Chuanxiong Rhizoma on autophagy of vascular endothelial cells; To discuss its mechanism for delaying high glucose and high fat-induced vascular endothelial cell senescence. Methods 40 mmol/L glucose and 100 μmol/L palmitate were used to establish model. The experiment was divided into control group, senescence model group and TCM group (200 mg/L) for 48 h. Cell proliferation was detected by CCK-8; cell senescence was detected by β-galactosidase staining; p16, p21, LC3B-Ⅱ and p62 protein expression levels were detected by Western blot; autophagy flux was detected by immunofluorescence. Results Compared with the control group, the cell proliferation ability and LC3B-Ⅱ expression decreased, the number of SA-β-gal blue-stained cells and expression of p16, p21 and

p62 increased, and autophagic flux blocked in the senescence model group. Compared with the senescence model group, extracts of Ginseng Radix et Rhizoma, Notoginseng Radix et Rhizoma and Chuanxiong Rhizoma could increase cell proliferation and LC3B-Ⅱ expression levels, reduce the number of SA-β-gal blue-stained cells and reduce the expression levels of p16, p21 and p62 and maintain the autophagic flux unobstructed. Conclusion Extracts of Ginseng Radix et Rhizoma, Notoginseng Radix et Rhizoma and Chuanxiong Rhizoma can delay endothelial

cellular senescence induced by high glucose and high fat, and its mechanism may be related to up-regulating cellular autophagy activity.

Keywords: extracts of Ginseng Radix et Rhizoma, Notoginseng Radix et Rhizoma and Chuanxiong Rhizoma; vascular endothelial cells; cellular senescence; autophagy

2 型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）目前已成

为严重威胁人类健康的疾病之一[1]，其中大血管并发症在其各种并发症中约占75%，是 T2DM患者致残致

[2]

死的主要原因 。研究表明，血管内皮功能紊乱是

T2DM大血管并发症的病理基础，而血管内皮细胞衰

老在内皮功能紊乱过程中发挥关键作用[3-4]。细胞自噬是一种不同于细胞凋亡的程序性死亡，可将细胞内受损细胞器、生物大分子等结构通过溶酶体降解，实现自我保护及维持稳态，自噬缺陷与癌症、神经退行

性变、炎症和代谢性疾病密切相关[5]。机体衰老过程中自噬活性逐渐衰减，在复制性和诱导性衰老的细胞中，通过不同途径适当上调自噬具有一定延缓细胞衰

老的作用[6-8]。本课题组前期研究发现，益气活血中药人参、三七、川芎能调节复制性衰老的微血管内皮细胞的自噬

水平[9]，但在高糖高脂诱导的衰老大血管内皮细胞中是否也有同样的调节作用，目前尚未见报道。因此，本研究以高糖高脂诱导的人主动脉内皮细胞衰老为模型，观察人参三七川芎提取物对细胞自噬的干预作用，为其临床应用提供依据。

1 实验材料

1.1 药物人参、三七、川芎合剂冻干粉，北京因科瑞斯医药科技公司制备提供。药物为道地药材，人参产自吉林，三七产自云南，川芎产自四川，按2∶3∶4 比例破碎成粗粉，乙醇回收提取，过滤后弃药渣，醇提液回收至无醇味浓缩液，继续浓缩至稠膏状，再经干燥至干膏，最终每1g冻干粉相当于原药材 4.286 g，使用时以 DPBS 配制成 10 g/L 的贮存液，以 0.22 μm 滤

器过滤分装，置于-20 ℃冰箱保存。依据药典对人参三七川芎提取物中指标性成分阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Re 和人参皂苷 Rb1 进行HPLC 分析[10]。

1.2 细胞

人主动脉内皮细胞（HAEC），美国 Sciencell 公司，并提供细胞鉴定书。

1.3 试剂内皮细胞培养基、胎牛血清、内皮细胞生长因子、青霉素/链霉素溶液、胰酶消化液、细胞冻存液，美国Sciencell 公司，批号分别为 1001、0025、1052、0503、

0103、0133；CCK-8 细胞增殖-毒性检测试剂盒，日本同仁化学研究所，批号LG615；细胞衰老 β-半乳糖苷酶检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司，批号 C0602；p21 兔单克隆抗体，p16 兔单克隆抗体，

LC3B 兔单克隆抗体、p62 小鼠单克隆抗体，英国Abcam 公司，批号分别为 ab109199、ab51243、

ab192890、ab56416；辣根酶标记山羊抗兔/山羊抗小鼠IgG（H+L），北京中杉金桥生物技术有限公司，批号 ZB-2301、ZB-2305；巴弗罗霉素，美国 MCE公司，批号 88899-55-2；自噬腺病毒载体系统 Ad-mRFPGFP-LC3，汉恒生物科技（上海）有限公司；D-葡萄糖、棕榈酸钠美国 Sigma 公司，批号分别为

SLBR0902V、SLBV2022；无脂肪酸 BSA（d-BSA），北京索莱宝公司，批号 1206F052。棕榈酸钠溶于 PBS

（95 ℃助溶）配成20 mmol/L 溶液，将 d-BSA 按质量/体积溶于 DPBS（55 ℃助溶）配成 20%d-BSA 溶液，将棕榈酸钠趁热加入到等体积的d-BSA 中，配成

10 mmol/L 棕榈酸钠（含 10%d-BSA）贮存液，4 ℃冰箱保存备用。

1.4 仪器

AE2000 型倒置相差显微镜及成像系统（中国麦克奥迪实业集团有限公司），Forma 370 型细胞培养箱（美国 Thermo 公司），Synergy H1 型全自动酶标仪（美国 Bio Tek 公司），FV1000 型激光共聚焦显微镜（日本 Olympus 公司），Mini-PROTEAN Tetra Cell 型电泳槽系统，PowerPac universal power supply 型通用电泳仪电源，Trans-blot sp cell 型半干转印槽（美国Bio-Rad 公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养

HAECs 培养于含5%胎牛血清、内皮生长因子、

青霉素（100 U/L）/链霉素（100 mg/L）的完全培养基，于饱和 5%CO2培养箱 37 ℃培养，至细胞密度为

80%～90%，按照 1∶2 或 1∶3 传代培养。根据前期实验结果，本实验采用 40 mmol/L D-葡萄糖联合

100 μmol/L 棕榈酸钠诱导HAEC 细胞衰老[11]。实验分为空白对照组、葡萄糖/棕榈酸诱导的衰老模型组和人参三七川芎提取物干预的中药组。

2.2 CCK-8 检测细胞增殖活力

细胞 5×103个/孔接种于 96孔板，每组设立6个复孔，待细胞贴壁后，每组进行相应的处理，药物作用指定时间后，将孔板中原液体吸出，向每孔内加入用基础培养基稀释成含 10%CCK-8 试剂液，置于

37 ℃培养箱中孵育2～3 h，于酶标仪 450 nm波长处检测吸光值。

2.3 细胞衰老β-半乳糖苷酶染色

待测细胞以 2×104个/孔接种于 24 孔板中，细胞贴壁后，吸除细胞培养液，DPBS洗涤 1次，每孔加

250 μL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min，吸除细胞固定液，DPBS洗涤细胞3次，每孔加 250 μL染色工作液，置于无CO2、37 ℃培养箱中孵育过夜。倒置光学显微镜下观察并计数，计算蓝染细胞数量占视野内总细胞量的比例。

2.4 Ad-mRFP-GFP-LC3 检测自噬流将状态良好的 HAECs 接种于激光共聚焦显微镜专用培养皿，贴壁24 h 后取 Ad-mRFP-GFP-LC3 腺病毒（病毒滴度为 1×107 PFU/mL）在冰上溶解，使用

完全培养基按感染复数（MOI）＝300稀释，处理4h后换成新鲜完全培养基，置于5%CO2培养箱 37 ℃培养过夜。根据实验分组干预48 h后置于荧光共聚焦显

微镜下观察细胞内自噬体的形成情况[12]。

2.5 Western blot检测微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ、p16、

p21 及 p62 蛋白表达

按 RIPA 蛋白抽提试剂说明提取各组总蛋白，经BCA法测定蛋白含量后调整蛋白浓度，加 5×loading

buffer，99 ℃变性 10 min；8%～12%SDS- PAGE 电泳，半干转印至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭 1h，1∶2000

稀释一抗，4 ℃过夜；TBST 清洗 3 次×5 min，1∶3000稀释二抗后室温孵育1h；TBST 清洗 3 次×5 min， ECL显示目的条带。采用 Image Lab图像分析系统对条带灰度值进行分析，并以 β-actin 为内参照。3 统计学方法

采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s — 表示，多组样本采用方差分析，若方差齐用 LSD法进行两两比较；若方差不齐则用 Dunnett's 法分析。

P＜0.05 表示差异有统计学意义。

4 结果4.1 人参三七川芎提取物中主要成分含量

经 HPLC检测，人参三七川芎提取物中5种主要成分含量见表1。

4.2 人参三七川芎提取物对细胞增殖能力的影响与空白对照组比较，高糖高脂干预48 h可明显抑制 HAECs 的增殖；与衰老模型组比较，25～200 mg/L人参三七川芎提取物可明显促进细胞的增殖能力，并呈浓度依赖性。但随着提取物浓度的进一步增加，细胞的增殖能力下降，其中 800、1000 mg/L 剂量组对细胞有明显的抑制作用。由此确定中药最佳干预剂量为 200 mg/L，后续中药组浓度选用该剂量进行实验。结果见图1。

4.3 人参三七川芎提取物对细胞衰老 β-半乳糖苷酶染色的影响

衰老模型组 β-半乳糖苷酶蓝染比例较空白对照

组明显增加（P＜0.05）；200 mg/L人参三七川芎提取物处理后β-半乳糖苷酶蓝染阳性比例明显降低，差异

有统计学意义（P＜0.01）。结果见图2、表 2。

4.4 人参三七川芎提取物对细胞衰老相关蛋白p16、

p21 的影响与空白对照组比较，衰老模型组HAECs p16、p21

蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05，

P＜0.01）；与衰老模型组比较，中药组 HAECs p16、

p21蛋白表达显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05，

P＜0.01）。结果见图 3。

注：A.空白对照组；B.衰老模型组；C.中药组；与空白对照组，#P＜0.05，

##P＜0.01；与衰老模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

图 3 各组 HAECs细胞衰老相关蛋白 p16、p21 表达比较（x±s，n＝4） —

4.5 人参三七川芎提取物对自噬相关蛋白微管相关蛋白 1 轻链 3-Ⅱ、p62 的影响

与空白对照组比较，衰老模型组自噬相关蛋白

LC3B-Ⅱ表达降低，p62 表达明显升高，差异有统

计学意义（P＜0.05）；与衰老模型组比较，中药组自噬相关蛋白 LC3B-Ⅱ表达明显升高，p62 显著下调，

差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见图 4。

注：A.空白对照组；B.衰老模型组；C.中药组；与空白对照组比较， #P＜0.05；与衰老模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

图 4 各组 HAECs细胞自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、p62 表达比较（x±s，n＝4） —

4.6人参三七川芎提取物对细胞自噬流的影响将感染 mRFP-GFP-LC3 双荧光标记腺病毒细胞进行分组刺激，mRFP（红色荧光）用于标记及追踪

LC3蛋白，溶酶体内部环境为酸性，当自噬小体与溶酶体融合，对酸性环境敏感的GFP（绿色荧光）淬灭。因此，红绿荧光 Merge 后，GFP+RFP+为黄色斑点，

即为自噬体，GFP-RFP+为红色斑点，即自噬溶酶体，红/黄色斑点数目多少，可清晰判断出自噬流的强弱及自噬流通畅与否。与空白对照组比较，衰老模型组黄斑点和红斑点数量均减少，表明自噬虽增强，而自噬流不通畅；与衰老模型组比较，人参三七川芎提取物干预均可明显增加黄、红斑点的数量，尤其是红色斑点，表明自噬流通畅。结果见图5。5 讨论自噬是细胞内一种“自食”现象，细胞利用溶酶体降解自身受损蛋白质、衰老或损伤的细胞器等细胞结构，从而保证细胞能量代谢和新旧细胞器更迭的顺

利进行[13]。自噬相关蛋白 LC3Ⅱ的表达能敏感反映自噬状态，当自噬小体形成时，胞浆型蛋白LC3Ⅰ经酶解转变为LC3Ⅱ，并被募集定位在自噬体膜上，其水平在一定程度上反映了自噬体数量和自噬程度。自噬标记蛋白 p62是多泛素化结合蛋白，自噬发生时p62作为自噬底物蛋白，参与自噬的过程并在自噬溶酶体

中降解，因此，p62 蛋白水平与自噬活性成反比，可

反映自噬反应的强弱[14]。细胞自噬与细胞衰老关系密切。在衰老过程中，细胞可通过启动自噬，清除受损的生物大分子和功能异常的线粒体等，避免损伤的累积，维持细胞形态正

常和功能的稳定，延长细胞寿命[15-16]。但糖尿病患者长期处于糖脂代谢紊乱状态，高糖和高脂环境通过抑制ULK1磷酸化、自噬小体形成和溶酶体降解等环节，

下调血管内皮细胞自噬水平[17-18]，这可能是导致血管内皮细胞进入衰老期，造成血管内皮完整性丧失和功

能紊乱，促进血管并发症形成的机制之一[19-20]。中医理论认为，气血是构成人体的最基本物质， “以奉生身，莫贵于此”，是脏腑经络等组织器官进行生理活动的物质基础，而气虚血瘀是人体衰老的主要病机。人参、三七、川芎三药联用有益气活血、通脉活络、延年益寿的功效。本研究采用人参三七川芎提取物干预高糖高脂处理的HAEC后，发现人参三七川芎提取物可促进细胞增殖，减少β-半乳糖苷酶蓝染细胞数量，并降低p16 和 p21表达水平，表明人参三七川芎提取物能有效延缓高糖高脂诱导的内皮细胞衰老。

进一步对细胞自噬机制研究发现，中药组既可增

加 LC3B-Ⅱ表达，也可降低 p62水平，表明人参三七川芎提取物能增强衰老内皮细胞的自噬活性，诱导细胞自噬的发生。自噬是一个细胞内的动态过程，即“自噬流”，细胞内自噬体的增加既可能由于自噬小体形

成的增加，也可能由于自噬小体降解的减少[21]。为明确人参三七川芎提取物作用于整个“自噬流”的环节，本研究利用 mRFP-GFP-LC3 双荧光标记腺病毒作为研究工具，发现在高糖高脂诱导的衰老细胞中，自噬流阻滞于下游自噬溶酶体的降解，表明其自噬活性的增强源于自噬流不通畅；而人参三七川芎提取物干预可明显增加黄、红斑点的数量，尤其是红色斑点，表明可促进自噬流通畅，中药组自噬活性增强是通过促进自噬小体的形成阶段从而促进整个细胞“自噬流”的顺利进行。

综上，本研究发现人参三七川芎提取物能通过调节细胞自噬延缓高糖高脂引起的血管内皮细胞衰老，可为减少糖尿病大血管并发症提供一定的借鉴和参考。然而，人参三七川芎提取物通过哪些具体分子信号通路增强自噬而延缓细胞衰老、其间内在联系是什么、如何保证自噬的平衡状态既可诱导又不至于过度等，这些问题在本研究中尚未涉及，需要今后进一步深入研究。

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（收稿日期：2018-10-28）

（修回日期：2019-02-14；编辑：华强）