艾烟可吸入物对大鼠神经细胞氧化损伤的影响

2019-04-15 -

李丹1，俞云2，李圆君3，惠鑫 1，王昊 1，韩丽4，王晶5，赵百孝 1

1.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029；2.中央民族大学生命与环境科学学院，北京 100081；

3.北京大学生命科学学院，北京 100871；4.北京中医药大学中医学院，北京 100029；

5.世界中医药学会联合会，北京 100101

摘要：目的探讨艾烟可吸入物（PM10）对大鼠神经细胞氧化损伤的影响及PI3K/Akt 信号通路在其中的作用。方法采用 24 h内新生SD大鼠乳鼠前额叶皮质及海马组织体外培养原代神经细胞，H2O2诱导建立氧

化损伤细胞模型；随机分为空白组、氧化损伤组、氧化损伤＋PM10组、氧化损伤＋PM10＋抑制剂组、PM10组。采用 TUNEL 和 DAPI染色观察神经细胞凋亡形态；MTT法及 Western blot分别检测细胞存活率及目的蛋白表达，并用 PI3K/Akt 通路抑制剂 LY294002 验证作用通路。结果 MTT 检测显示，200 μmol/L H2O2能降低神经细胞 50%存活率（P＜0.001），0.1、0.5 ng/mL 艾烟 PM10 能明显抑制 H2O2诱导氧化损伤的神经细胞凋亡

（P＜0.001）；TUNEL 和 DAPI 染色显示，0.5 μg/mL 艾烟 PM10 能拮抗 H2O2诱导氧化损伤神经细胞凋亡的形

态学变化（P＜0.001）；Western blot 检测显示，H2O2及 LY294002 能降低 p-Akt、Bcl-2 的表达（P＜0.05，P＜

0.001），上调 active-Caspase-3 的表达（P＜0.01，P＜0.001），而艾烟 PM10 作用相反（P＜0.01，P＜0.001）。结论艾烟 PM10 能减少神经细胞氧化应激的凋亡，其机制可能是激活 PI3K/Akt 信号通路并调控下游凋亡蛋白 Bcl-2、active-Caspase-3 的表达，拮抗细胞凋亡。

关键词：艾烟 PM10；过氧化氢；细胞凋亡；PI3K/Akt 信号通路；大鼠

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)04-0042-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.04.010 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Inhalation of Moxa Smoke on Oxidative Damage of Neurons of Rats

LI Dan1, YU Yun2, LI Yuanjun3, HUI Xin1, WANG Hao1, HAN Li4 ,WANG Jing5, ZHAO Baixiao1

1. School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China; 2. School of Life and Environmental Sciences, Central University for Nationalities, Beijing 100081, China;

3. School of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China; 4. School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;

5. World Federation of Chinese Medicine Societies, Beijing 100101, China

Abstract: Objective To investigate the effects of inhalation of Moxa smoke on oxidative damage of neuronsand the role of PI3K/Akt signaling pathway. Methods Primary cultured neurons were cultured in the prefrontal cortex and hippocampus of neonatal SD rats within 24 hours. H2O2 was used to establish the oxidative damage cell model. They were randomly divided into blank group, injury group, PM10 + injury group, PM10 + injury + inhibitor group and

PM10 group. Morphological changes of neuronal apoptosis were observed by TUNEL and DAPI staining. Cell viability and protein expression were detected by MTT and Western blot, and the pathway was verified by PI3K/Akt pathway inhibitor LY294002. Results MTT showed that 200 μmol/L H2O2 could reduce the 50% survival rate of neurons (P<0.001). 0.1, 0.5 ng/mL Moxa smoke PM10 could significantly inhibit the apoptosis of neurons induced by

H2O2 (P<0.001). TUNEL and DAPI staining showed that 0.5 μg/mL Moxa smoke PM10 could antagonize the morphological changes of H2O2-induced oxidative damage in neuronal apoptosis (P<0.001); Western blot showed that

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81574068、81874503）；北京中医药大学校级自主课题（2018-JYBZZ-XS113）

通讯作者：赵百孝，E-mail：baixiao100@vip.sina.com

H2O2 and LY294002 could decrease the expressionsof p-Akt and Bcl-2 (P<0.05, P<0.001), and up-regulated the expression of active-Caspase-3 (P<0.01, P<0.001), while the effect of PM10 was opposite (P<0.01, P<0.001). Conclusion Moxa smoke PM10 can reduce the apoptosis of neurons under oxidative stress by activating PI3K/Akt signaling pathway and regulating the expressions of downstream apoptotic proteins Bcl-2 and active-Caspase-3.

Keywords: Moxa smoke; H2O2; apoptosis; PI3K/Akt signaling pathway; rats

氧化应激是指活性氧簇（ROS）的生成和清除失平衡状态，这一病理过程与许多疾病发生发展密切相

关。艾烟可吸入物（PM10）是传统中医灸法的燃烧

产物，含有多种生物活性成分[1-2]，具有抗氧化应激、

抗自由基、杀菌等作用[3-8]。近年研究表明，艾烟能激活 PI3K/Akt 信号转导通路，从而产生作用[9]。相关研究表明，激活 PI3K/Akt 信号转导通路可抑制 H2O2

引起的氧化损伤，从而延缓疾病的发生发展[10]。本实验采用 H2O2诱导建立原代神经元氧化损伤模型，予艾烟 PM10 预处理，观察其对 H2O2介导神经元损伤的保护作用，并通过加入 PI3K/Akt 信号通路阻断抑制剂 LY294002 阐明其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

新生 1 日龄 SD大鼠乳鼠3只，北京大学医学部实验动物中心提供，动物许可证号 SCXK （京）

2016-0006。所有乳鼠饲养于 SPF 级动物室，室温20～

25 ℃，相对湿度60%～80%，保持通风，定时换气，每日光照 12 h。

1.2 主要试剂与仪器MTT、DAPI、多聚赖氨酸溶液（美国 Sigma 公司），TUNEL 试剂盒（美国 CST 公司），MEM EARLES （美国 Invitrogen 公司），谷氨酰胺、B27 （美国Invitrogen 公司），阿糖胞苷（美国 Sigma 公司），胎牛血清、马血清、胰蛋白酶（美国 Invitrogen 公司），

Bcl-2 抗体、active-Caspace-3 抗体（美国 Invitrogen公司），p-Akt 和 T-Akt 抗体（美国 Invitrogen 公司），

LY294002（美国 CST 公司）。CKX41-倒置显微镜（日本 Olympus 公司），5417R 高速冷冻离心机（德国Eppendodf 公司），荧光/吸收光酶标仪（美国 Therm

公司），Tanon4200 化学发光成像仪（上海天能）。

实验方法

2.1 艾烟可吸入物制备实验用艾条为南阳汉医艾绒有限责任公司三年蕲艾条。将艾绒置于玻璃箱中点燃，将 Mini VolTM

PM10 便携式采样器置于玻璃箱中采集烟雾，吸附在剑桥滤片上。采样前后剑桥滤片的质量差即为采集的艾燃烧产物的质量。用 DMSO 溶解 PM10 制成终浓度为 100 mg/mL的艾燃烧生成物原溶液，除菌过滤并

避光存储于-80 ℃冰箱备用。每次实验前用培养液稀释至所需浓度（DMSO浓度≤1%）。

2.2 分组和造模实验随机分为空白对照组、氧化损伤组、氧化损

伤＋PM10组、氧化损伤＋抑制剂＋PM10 组、PM10组。原代神经元培养：从新生SD大鼠分离海马及前

额叶脑组织，0.25%胰蛋白酶消化、离心细胞并重新悬浮。将细胞铺覆在用多聚赖氨酸涂覆的板上，培养

2～4 h，2%马血清、2%B27 和 1%GlutaMAX MEM EARLES 继续培养，3 d 后 10 nmol/L 阿糖胞苷处理细胞抑制胶质细胞生长。用前细胞培养7～8 d。

2.3 干预

培养 7 d 后，不同浓度 PM10（自制）加入到原代神经细胞培养基24 h，或用 200 μmol/L H2O2处理神经元 24 h构建神经细胞氧化应激损伤模型。在研究药物作用通路的实验中，用Akt 抑制剂 LY294002（终浓度 10 μmol/L）提前处理细胞 30 min。再用 PM10处理细胞。

2.4 指标检测

2.4.1 MTT法检测细胞存活率给药后继续孵育细胞 24 h，之后每孔加入 MTT （终浓度 0.5 ng/mL），于 37 ℃、5%CO2培养箱中避光继续孵育 24 h，吸去培养液，每孔加入 150 μL DMSO 液，待孔内颗粒完全溶解后，酶标仪 570 nm处测定各孔吸光度，计算各组细胞存活率[细胞吸光度－空白孔吸光度）÷（对照组细胞吸光度－空白孔

吸光度）×100%]。

2.4.2 TUNEL法检测细胞凋亡

4%PFA 和 4%蔗糖在 PBS 中固定细胞 30 min， PBS 洗涤后，加入 0.1%Triton X-100 和 0.1%柠檬酸钠的PBS冰育2 min。用 PBS洗涤2次后加适量TUNEL

检测液，37 ℃避光孵育60 min，PBS 洗涤后加适量

DAPI，37 ℃避光孵育60 min，PBS 洗涤 3次。用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。TUNEL染色细胞凋亡的细胞核为绿色荧光，DAPI 染色细胞核为蓝色荧光。细胞凋亡百分率通过计算比值来确定。TUNEL阳性细胞数在1个计数中共 100 个细胞。

取 5个计数的平均值为神经元细胞死亡的百分比。

2.4.3 Western blot 检测蛋白表达各组按实验设计给药后继续孵育细胞24 h，洗涤后裂解细胞，冰上反应30 min，离心，取上清液。BCA法测定各组蛋自浓度，将每个样品蛋白浓度调成一

致，10%SDS-PAGE 分离蛋自质，PVDF 转膜后奶粉封闭 30 min，一抗（1∶1000）孵育过夜（4 ℃），TBST洗 3～5 次，二抗（1∶1000）室温孵育 1h，TBST 漂洗，化学发光成像仪检测蛋白表达量。3 统计学方法

采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s — 表示，两组间进行独立本t检验。检验水准α＝0.05。4 结果

4.1 MTT检测结果与空白对照组比较，氧化损伤组细胞存活率明显

降低（P＜0.001），表明造模成功。加入 0.1、0.5 ng/mL

PM10 能提高氧化损伤细胞的存活率，与氧化损伤组

比较差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.001）。另外，相同浓度 PM10 组较空白对照组细胞存活率略高

（P＜0.05），表现出一定浓度 PM10对细胞凋亡的保护作用。提示 PM10 对 H2O2诱导神经细胞的氧化应激损伤具有抑制作用。结果见图1。

注：A.空白对照组；B.氧化损伤组；C.氧化损伤＋0.1 ng/mL PM10 组；

D.氧化损伤＋0.5 ng/mL PM10 组；E.氧化损伤＋1.0 ng/mL PM10 组；

F.0.1 ng/mL PM10 组；G.0.5 ng/mL PM10 组；H.1.0 ng/mL PM10 组；与A 比较，*P＜0.05，***P＜0.001；与 B 比较，##P＜0.01，###P＜0.001图 1各组神经细胞存活率比较（x±s，n＝5） —

4.2 TUNEL 和 DAPI 染色结果相近细胞数目情况下，氧化损伤组较空白对照组

细胞凋亡率明显增加（P＜0.01）。氧化损伤＋PM10

组较氧化损伤组细胞凋亡率下降（P＜0.001）。提示

PM10 对 H2O2诱导神经细胞凋亡损伤有抑制作用。结果见图2、图 3。

4.3 Western blot 检测结果与空白对照组比较，氧化损伤组细胞p-Akt 蛋白

表达量明显下降（P＜0.001）；与氧化损伤组比较，

氧化损伤＋PM10 组神经细胞 p-Akt 蛋白表达量明显

增加（P＜0.01）；加入 PI3K/Akt 通路抑制剂 LY294002

后，与氧化损伤＋PM10 组比较，PM10 这种拮抗作

用消失（P＜0.05），提示 PI3K/Akt 信号通路参与了

PM10 拮抗 H2O2诱导的神经细胞损伤的保护作用。结果见图4。

注：A.空白对照组；B.氧化损伤组；C.氧化损伤＋0.5 ng/mL PM10 组；

D.0.5 ng/mL PM10 组

图 2 各组神经细胞凋亡阳性表达（×200） 60

注：A.空白对照组；B.氧化损伤组；C.氧化损伤＋0.5 ng/mL PM10 组；

D.0.5 ng/mL PM10 组；与A 比较，***P＜0.001；与 B 比较，##P＜0.01图 3 各组神经细胞凋亡率比较（x±s，n＝5） —

注：A.0.5 ng/mL PM10 组；B.空白对照组；C.氧化损伤组；D.氧化损伤＋

0.5 ng/mL PM10 组；E.氧化损伤＋0.5 ng/mL PM10＋10 μmol/L 抑制剂组；与B 比较，***P＜0.001；与 C 比较，##P＜0.01；与 D 比较，△P＜0.05图 4 各组神经细胞 PI3K/Akt 信号通路蛋白表达比较（x±s，n＝5） —

与氧化损伤组比较，氧化损伤＋PM10组细胞Bcl-2

表达明显增加（P＜0.001），而加入 PI3K/Akt 通路抑制剂 LY294002 后，与氧化损伤＋0.5 ng/mL PM10 组

比较，PM10 拮抗作用消失（P＜0.05），提示 PI3K/Akt信号通路及其调控的凋亡蛋白Bcl-2 参与了PM10拮抗

H2O2诱导的神经细胞损伤的保护作用。结果见图5。

A B C D E

注：A.0.5 ng/mL PM10 组；B.空白对照组；C.氧化损伤组；D.氧化损伤＋

0.5 ng/mL PM10 组；E.氧化损伤＋0.5 ng/mL PM10＋10 μmol/L 抑制剂组；与B 比较，***P＜0.001；与 C 比较，###P＜0.001；与 D 比较，△P＜0.05图 5 各组神经细胞 Bcl-2 蛋白表达比较（x±s，n＝5） —

与氧化损伤组比较，氧化损伤＋PM10 组神经细

胞 active-Caspase-3 表达量下调（P＜0.01），而加入

PI3K/Akt 通路抑制剂 LY294002 后，与氧化损伤＋

0.5 ng/mLPM10 组比较，PM10 拮抗作用明显减弱

（P＜0.01），提示 PI3K/Akt 信号通路及其调控的凋亡

蛋白 active-Caspase-3 参与了 PM10 拮抗 H2O2诱导的神经细胞损伤的保护作用。结果见图6。A B C D E

注：A.0.5 ng/mL PM10 组；B.空白对照组；C.氧化损伤组；D.氧化损伤＋

0.5 ng/mL PM10 组；E.氧化损伤＋0.5 ng/mL PM10＋10 μmol/L 抑制剂组；

与B 比较，***P＜0.001；与 C 比较，##P＜0.01；与 D 比较，△△P＜0.01图 6 各组神经细胞 active-Caspase3 蛋白表达比较（x±s，n＝5） —讨论氧化应激是指细胞暴露于高浓度氧分子或氧的化学衍生物而引起的细胞损伤。生理条件下的 ROS物质能刺激细胞生长，抗氧化系统与其抗衡，当平衡状态被破坏，自由基等大量聚集，引起人体脂质过氧化及蛋白质等变性，导致细胞膜的流动性和通透性发

生改变，最终导致细胞结构和功能改变[11]。

H2O2 是一种易于获得的重要 ROS，性质相对稳定，极易透过细胞膜，与细胞内铁离子通过FENTON反应形成高活性的自由基，导致一系列反应，已成为

研究各类细胞氧化损伤的重要工具[12]。故本实验选择

H2O2 处理神经细胞建立氧化应激损伤模型，并通过MTT检测细胞存活率来验证造模是否成功。

氧化应激是许多疾病的诱发因素和病理过程[12]，与心脑血管疾病的发生发展息息相关，是阿尔茨海默病的病因假说。因此，缓解细胞组织的氧化应激损伤无疑成为一种有效防治这类疾病的潜在方案。目前许多在体实验已经证实艾烟能减缓阿尔茨海默病氧化

[13-15]应激损伤，从而防治其发生发展。本实验采用神经元原代培养方法，采用 MTT、DAPI 和 TUNEL 方法检测细胞损伤情况，Western blot 验证作用通路相关蛋白，实验结果显示终浓度为200 μmol/L H2O2处理组细胞存活率为50%左右，与正常对照组比较，差异

有统计学意义（P＜0.01，P＜0.001）。0.5 ng/mL PM10预先干预氧化损伤细胞，可显著减少细胞凋亡，与氧

化损伤组比较，差异有统计学意义（P＜0.001），与Western blot 结果一致。实验发现PM10 作用于氧化损伤细胞，激活 PI3K/Akt 信号通路，增加 p-Akt、Bcl-2下游蛋白表达，并抑制 active-Caspase3 的表达（P＜

0.01，P＜0.001），当加入 Akt 通路阻断剂 LY294002后，各相关蛋白结果相反，证实了其作为通路之一为

PI3K/Akt 信号通路的假设。艾灸已被用于治疗各种类型的疾病，但仍无足够的证据直接证明其有效性。本实验首次证明了 PM10对神经细胞氧化诱导凋亡的保护作用，特别是对阿尔茨海默病相关细胞的影响，结果可作为证明艾灸有效性的证据之一，其中艾烟也被验证成为艾灸起效的关键因素，同时为治疗阿尔茨海默病提供潜在防治方案，而 PM10起效浓度、混合物的纯化及相关研究仍需进一步深入完善。

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