新疆石榴皮 HPLC 指纹图谱研究

常占瑛1，刘桂花2，王梅1，古丽巴合尔•卡吾力1，布鲁根1，高晓黎 1

1.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004摘要：目的 建立新疆石榴皮HPLC指纹图谱。方法 采用 Agilent SB-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），

流动相为甲醇-0.1%三氟乙酸溶液，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温 30 ℃，检测波长370 nm，进样量 10 μL，测定 12批石榴皮样品，运用相似度分析软件建立石榴皮指纹图谱共有模式，并对色谱峰进行指认。结果 建立了石榴皮 HPLC 指纹图谱，标定了 18 个共有峰，3个色谱峰得到指认，分别为 α-安石榴苷、β-安石榴苷、鞣花酸。结论 本研究建立的石榴皮HPLC指纹图谱方法稳定可行，可用于控制石榴皮质量。关键词：石榴皮；指纹图谱；高效液相色谱法

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)04-0074-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.04.016 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on HPLC Fingerprints of Granati Pericarpium

CHANG Zhanying1, LIU Guihua2, WANG Mei1, Gulibahar KAWULI1, BU Lugen1, GAO Xiaoli1

1. Pharmacy College of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China;

2. Xinjiang Institute of Meteria Medica, Urumqi 830004, China

Abstract: Objective To establish HPLC fingerprints of Granati Pericarpium. Methods The Agilent SB-C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) was adopted with gradient elution by mixture of methanol-water (0.1% trifluoroacetic acid) as the mobile phase. The detection wavelength was 370 nm; the flow rate was 1.0 mL/min; the column temperature was 30 ℃; the sample size was 10 μL. 12 batches of Granati Pericarpium were determined, and the common model was established by using the similarity analysis software. Chromatographic peaks were identified. Results The HPLC fingerprints of Granati Pericarpium was established and 3 out of the 18 common peaks in the fingerprint were identified, which were α-punicalagin, β-punicalagin, ellagic acid. Conclusion The established HPLC fingerprint method of Granati Pericarpium is stable and feasible, which can be used for the quality control of Granati Pericarpium.

Keywords: Granati Pericarpium; fingerprints; HPLC

石榴 Punica granatum L.为石榴科 Punicaceae 石榴属 Punica L.落叶灌木或小乔木，别名安石榴[1]。石榴原产于地中海及亚洲西部地区，约公元前2世纪传入我国。目前，我国栽培石榴主要有六大产区，新疆是我国最西部的石榴产区，种植主要分布在喀什、和田等地。石榴是一种药食同源的植物资源，其叶、花、汁、籽、果皮、根皆可入药。研究表明，石榴具有清除自由基、调节血脂、预防心脑血管疾病、抗氧化、抗病毒、抗癌及改善妇女围绝经期综合征等多种生理和药理活性[2]。石榴皮在食品、医药等领域有巨大的

基金项目：新疆维吾尔自治区中医民族医药科技人才项目

（ 2016-3-10 ）；新疆维吾尔自治区高校科研计划项目（XJEDU2017S021）通讯作者：高晓黎，E-mail：xli_g@sina.com

应用价值[3-5]，从 1963年起收载入《中华人民共和国药典》，用于治疗久泻、久痢、便血、脱肛、崩漏、白带和虫积腹痛。

石榴皮含有多酚、黄酮、氨基酸、微量元素等多种化学成分。石榴多酚是石榴皮中多酚羟基化合物的总称，主要存在于石榴果皮中，约为其干质量的

10.4%～21.3%，主要成分包括安石榴苷、没食子酸、表儿茶素、石榴皮鞣素等，其中安石榴苷含量最

高[4-5]。安石榴苷是目前发现仅存在于石榴多酚中的特异性成分，也是其主要的单一成分，约占石榴皮总酚含量的 65.75%，远高于鞣花酸和石榴皮鞣素等成分，安石榴苷在体内外均具有很强的抗氧化、抗癌、

抗菌及抗动脉粥样硬化等作用[6-7]。本试验综合运用相似度评价、主成分分析方法，对石榴皮进行HPLC指纹图谱研究，为其质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Agilent1220LC 型高效液相色谱仪（美国安捷伦

公司），AB135-S 型电子天平（瑞士梅特勒公司），

HH-S4 数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公

司），KQ5200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率200 W，频率 40 kHz）。

安石榴苷对照品（批号 MUST-17052603，纯度≥

98.12）、鞣花酸对照品（批号MUST-18030601，纯度≥

99.65），成都曼斯特生物科技有限公司；色谱甲醇，

三氟乙酸。12 批石榴皮样品（2015 年 10 月采集，S1、

S2、S3 产地为和田策勒县，S4、S5、S6 产地为和田

皮山县，S7、S8、S9 产地为喀什市，S10、S11、S12产地为喀什叶城县）经新疆医科大学药学院帕丽达•阿不力孜教授鉴定，均为石榴科植物石榴 Punica granatum L.的成熟干燥果皮。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为 Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，

5 μm），流动相为 0.1%三氟乙酸-甲醇，梯度洗脱（0～

10 min，5%甲醇；10～25 min，20%甲醇；25～35 min，

45%甲醇；35～45 min，65%甲醇），检测波长 370 nm，流速 1 mL/min，进样量 10 μL，柱温 30 ℃。

2.2 对照品溶液的制备精密称取适量安石榴苷、鞣花酸对照品，置棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容、摇匀，制成每1 mL 各含 75 —g的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密称定 25 mg石榴皮，置容量瓶中，精密加入

25 mL甲醇，称定质量，超声处理20 min，放室温至冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀混合，精密吸取5 mL 至 10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀混合，过 0.22 μm微孔有机滤膜，即得。

2.4 样品测定精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，按

“2.1”项下条件进样，记录 45 min 色谱图。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验

取“2.3”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于 0.26%，相对峰面积 RSD 均小于 3.0%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验

取“2.3”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于 0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，测得各色谱峰相对保留时间RSD 均小于 0.30%，相对峰面积 RSD 均小于3.0%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验

按“2.3”项下方法平行制备 6份供试品溶液，按

“2.1”项下条件分析，测得各色谱峰相对保留时间RSD 均小于 0.5%，相对峰面积 RSD 均小于 3.0%，表明该方法重复性良好。

2.6 指纹图谱的建立

2.6.1 参照峰选择

石榴皮中鞣花酸色谱峰（18号峰）峰形相对比较对称，且含量稳定，故将鞣花酸色谱峰定为石榴皮HPLC指纹图谱的参照峰。

2.6.2 共有峰标定及化学成分指认

取 12 批石榴皮样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，选择较稳定的色谱峰，结果共标定了 18 个色谱峰为石榴皮 HPLC 指纹图谱的共有指纹峰（见图1、图 2）。12批石榴皮样品指纹图谱见图3。采用面积归一化法计算，18个共有峰的峰面积之和占总峰面积的90%以上，根据保留时间，指认4号峰为 α-安石榴苷，5 号峰为 β-安石榴苷，18 号峰为鞣花酸。以鞣花酸色谱峰作为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。结果相对峰面积的RSD为0～2.97%，相对保留时间的RSD为0～0.73%，具有非常强的一致性，符合指纹图谱的技术要求

（RSD＜3%），见表 1、表 2。

2.6.3相似度分析

将 12 批石榴皮 HPLC 指纹图谱导入《中药色谱

指纹图谱相似度评价系统（2004A）》软件中，对其相

似度进行分析。12批石榴皮指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致，指纹特征峰的相对保留时间基本一致，表明四产地的样品差异不大。相似度计算结果（见表 3）表明，不同产地石榴皮化学成分的组成基本一致。石榴皮指纹图谱中共标定了 18 个共有峰，整个色谱图可分为3个区域：第一指纹特征区的保留时间3 讨论研究中药指纹图谱主要有化学方法和生物方法两类。化学方法包括HPLC、质谱指纹图谱法、红外光谱指纹图谱法、紫外分光光度法及高效毛细管电泳指纹图谱法；生物方法包括 DNA 法和生物色谱法。其中以 HPLC最为常用，具有较高分离效能、分析速度快、检测灵敏性好、选择性强、应用范围广等优点。本试验建立的石榴皮HPLC指纹图谱信息量大、操作简便、外界因素影响可控，具有较高的色谱重现性且稳定性良好，可用于石榴皮的质量评价。

在流动相的选择上，本试验尝试了甲醇-0.2%磷

酸、乙腈-0.5%磷酸、甲醇-乙腈-0.2%三氟乙酸[8]、乙

腈-0.1%三氟乙酸、甲醇-0.1%三氟乙酸等溶剂系统作

为流动相，结果以乙腈-0.1%三氟乙酸与甲醇-0.1%三氟乙酸作为流动相的分离效果、峰型均相差不大，因

此，选择采用甲醇-0.1%三氟乙酸作为流动相进行梯度洗脱。

参考文献：

[1] 蔡霞,刘悦,张芳芳,等.石榴的化学成分与质量控制研究进展[J].世段约在 0～22 min处，该区特征指纹峰较多，共6 个，其中 4号峰为α-安石榴苷，5 号峰为β-安石榴苷，且二者相对含量较大，是整个指纹图谱中较为重要的 2个峰；第二指纹特征区的保留时间段约在22～28 min处，该区共有5个特征指纹峰，峰形较好且含量相对较小；第三指纹特征区的保留时间段约在28～40 min处，该区共有7 个特征指纹峰，18号峰为鞣花酸色谱峰，因其含量较高、峰形较好、基本对称，故以其作为石榴皮 HPLC指纹图谱的参照峰。

界科学技术－中医药现代化,2014,16(1)：123-129.

[2] 毕晓菲,李勇.石榴化学成分及其保健功能的研究进展[J].现代农业

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（收稿日期：2018-05-31）

（修回日期：2018-07-12；编辑：陈静）