响应面法优化金果榄多糖提取工艺及抗氧化活性研究

2019-04-15 -

蒋德旗 1，2，柒善怀 1，张兰熙1，赵仕花1，卢燕燕 1

1.玉林师范学院生物与制药学院，广西玉林 537000；

2.广西农产资源化学与生物技术重点实验室，广西玉林 537000

摘要：目的研究复合酶提取金果榄多糖的最佳条件，并探讨其体外抗氧化活性。方法复合酶种类及配

比为纤维素酶∶果胶酶∶木瓜蛋白酶＝1∶1∶1，液料比固定为 20 mL/g，以金果榄多糖得率为响应值，在单因素试验基础上，以酶解pH值、酶解时间、复合酶添加量、酶解温度为自变量，采用响应面法建立数学模型，筛选最佳提取工艺；采用DPPH 自由基、羟自由基（•OH）、超氧阴离子自由基（O2-•）清除能力体系评价金果榄多糖体外抗氧化活性。结果金果榄多糖最佳提取条件为：酶解pH 值 5.1，酶解时间 56 min，复合酶添加量 2.0%，酶解温度 52 ℃。在此条件下多糖得率为 14.03%，与理论值 14.12%的相对误差＜5%。酶解温度对多糖得率影响最显著，酶解时间、酶解pH值次之，酶添加量影响最小。金果榄多糖对DPPH、•OH、O2-•清除的半数抑制浓度分别为 1.358、0.927、1.096 mg/mL，与维生素 C比较，抗氧化活性较弱。结论本研究优选的金果榄多糖复合酶法提取工艺方便可行，酶解得到的多糖具有较强的体外抗氧化活性。关键词：金果榄；多糖；响应面法；复合酶；抗氧化活性

中图分类号：R284.2；R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)04-0085-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.04.018 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of Extraction Process of Polysaccharide from Tinosporae Radix by Response Surface Method and Study on Its Antioxidant Activity

JIANG Deqi1, 2, QI Shanhuai1, ZHANG Lanxi1, ZHAO Shihua1, LU Yanyan1

1. College of Biology and Pharmacy, Yulin Normal University, Yulin 537000, China;

2. Guangxi Key Laboratory of Agricultural Resources Chemistry and Biotechnology, Yulin 537000, China Abstract: Objective To optimize extraction process for polysaccharides from Tinosporae Radix through compound enzymatic hydrolysis; To investigate its antioxidant activity in vitro. Methods The types and ratios of the complex enzymes were cellulase: pectinase: papain = 1:1:1. The liquid-to-solid ratio was fixed at 20 mL/g, and the yield of the polysaccharide from Tinosporae Radix was the response value. On the basis of single factor experiment, the enzymatic hydrolysis pH value, enzymatic hydrolysis time, complex enzyme addition amount and enzymatic hydrolysis temperature were used as independent variables, and the response surface method was used to establish a mathematical model to screen the optimal extraction process. DPPH, •OH, O2-• free radical scavenging system was used to evaluate in vitro antioxidant activity of polysaccharide from Tinosporae Radix. Results The optimum extraction conditions were as follows: enzymatic hydrolysis pH value was 5.1; enzymolysis extraction time duration was 56 min; the compound enzyme concentration was 2.0%; enzymolysis extraction temperature was 52 ℃. Under the optimal conditions, there was a difference of less than 5% between predicted extraction rate 14.12% and experimental extraction rate 14.03%. The polysaccharide yield was most significantly affected by enzymolysis extraction temperature, followed by enzymolysis extraction time duration, enzymolysis pH value and compound enzyme concentration. The half-inhibitory concentration of polysaccharide from Tinosporae Radix for DPPH, •OH, and O2-• free radical scavenging was 1.358, 0.927, and 1.096 mg/mL, respectively. Antioxidant activity of sample polysaccharides was weaker than those of vitamin C. Conclusion Extraction process for polysaccharides from

基金项目：广西自然科学基金（2016GXNSFBA380040）；玉林市科学研究与技术开发计划项目（玉市科攻 20173104）；玉林

师范学院高层次人才科研启动基金（G20160006）

通讯作者：赵仕花，E-mail：zscfl2@163.com

Tinosporae Radix through compound enzymatic hydrolysis is convenient and feasible, and extracted polysaccharides have good antioxidant activity in vitro.

Keywords: Tinosporae Radix; polysaccharide; response surface method; compound enzyme; antioxidant activity

金果榄为防己科植物青牛胆或金果榄的干燥块根，主要分布于我国广西、四川、贵州等西南地区。金果榄主要含有季铵生物碱、萜类、甾醇类及多糖等

化学成分[1-2]，性寒味苦，具有清热解毒、清喉利咽、消肿止痛功效，临床主要用于治疗急慢性咽喉炎、扁

桃体炎、菌痢、痈肿疔疖等[3-4]，有“壮药中的广谱

抗菌素”之称[5]。目前对其萜类及生物碱成分的药理作用研究较多，而对金果榄多糖的相关研究鲜见报道。现代药理学研究表明，天然产物多糖具有抗炎、抗氧化、抗衰老、降低血糖及增强免疫等多种

药理作用[6-8]，且生物活性强、毒副作用少[9]。本研究采用响应面法优化复合酶提取金果榄多糖的工艺条件，并探讨其体外抗氧化活性，为金果榄多糖成分进一步开发为药品及食品抗氧化添加剂提供一定的依据。

1 仪器与试药

5810R 型高速冷冻离心机，德国 Eppendorf；

Alpha-1506 型紫外分光光度计，上海谱元仪器有限公

司；SHA-BA双功能水浴恒温振荡器，常州华普达教

学仪器有限公司；PHS-25型pH 计，上海雷磁；SHB-III

型循环水真空泵、2L-ARE 旋转蒸发器，上海皓庄仪

器有限公司。

金果榄购自广西玉林众康大药房，经玉林师范学院生物与制药学院陈晓白教授鉴定为防己科植物金果榄 Tinospora capillipes Gagnep.的干燥块根；维生素 C （批号 100425-201709），中国食品药品检定研究院； D-无水葡萄糖（批号 20171104）、超氧阴离子自由基

（O2-•）和羟自由基（•OH）清除能力检测试剂盒（批号 20180105），北京索莱宝科技有限公司；纤维素酶

（5 万 U/g，批号 20171205）、果胶酶（10 万 U/g，批号 20171108 ）、木瓜蛋白酶（ 8 万 U/g ，批号

20171013），江苏锐阳生物技术公司；DPPH（批号

D4313-6HOG4），日本 TCI 公司；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取方法

多糖提取方法参照文献[10]进行，主要包括粉碎

过筛（100目）、特定酶解条件下提取、高温灭活、分离浓缩、乙醇沉淀、Sevage法脱蛋白、二次醇沉、真空冷冻干燥等系列步骤。

2.2 多糖含量测定采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。以葡萄糖浓度

为横坐标，490 nm波长处吸光度值为纵坐标，得标准曲线方程为 Y＝8.498 6X－0.018 5，r2＝0.990 3，表明葡萄糖的线性范围为 20～120 μg。多糖得率（%）＝

CnV/m×100%，C 为样品稀释液中多糖浓度（mg/mL）， n 为稀释倍数，V 为样品稀释液体积（mL），m 为金果榄粉末质量（mg）。

2.3 单因素试验酶解时的摇床转速固定为 180 r/min，液料比为

20 mL/g，复合酶（纤维素酶-果胶酶-木瓜蛋白酶）配比为 1∶1∶1[11]，分别考察酶解 pH 值、酶解时长、酶添加量和酶解温度对金果榄多糖得率的影响，其中各因素固定水平为 pH 值 5.0、酶添加量 2.0%、酶解时间 60 min、酶解温度 50 ℃。

2.3.1 复合酶添加量复合酶添加量分别为 1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、

3.0%时的多糖得率见图 1。当复合酶添加量增加到

2.0%时，多糖得率可达 13.47%，进一步加大酶用量，多糖得率无显著提升，说明在该底物浓度下酶浓度已趋于饱和，继续增加复合酶用量对多糖得率没有显著影响，故选择2.0%作为酶的最佳添加量。2.3.2 酶解 pH 值

酶解 pH 值分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 时的多糖得率见图2。当 pH值增加到 5.0 时，多糖得率达到最大值 13.72%，pH 值为 6.0时多糖得率反而减小，这主要与 pH 值过高或过低影响酶本身活性有关，故酶解最适pH值选定为 5.0。

2.3.3酶解温度

酶解温度分别为 30、40、50、60 ℃时的多糖得率见图 3。随着温度升高，多糖得率先增大后减小，这是由于温度过高导致酶活力减弱所致，故选择最适酶解温度为50 ℃。

2.3.4酶解时间

酶解时间分别为 20、40、60、80、100 min 的多糖得率见图4。当酶解时间为 60 min时，多糖得率为

13.68%，接近 80 min 时的最大值 13.76%，再延长提取时间，多糖得率反而减小。这是因为酶解时间过长，酶催化活性减弱，反而不利于多糖提取。考虑到实际生产效率，故选择60 min为最佳酶解时间。2.4响应面试验设计及结果

响应面试验设计自变量为酶解pH值、酶解时间、酶添加量、酶解温度4个因素，以多糖得率为响应值，采用 Design Expert 8.06 软件进行数据分析。因素水平见表 1，试验设计及结果见表 2，回归模型方差分析见表3。

对表2中数据进行回归拟合，获得自变量（酶解pH、酶解时间、酶添加量、酶解温度）对金果榄多糖

得率的二次多项回归方程：Y＝13.86－0.19A－0.64B－

0.17C＋0.98D－1.86AB－0.61AC＋2.07AD－0.56BC＋

0.41BD＋0.17CD－2.06A2－2.49B2－0.74C2－1.65D2。方差分析结果显示，回归方程模型 P＜0.000 1，失拟

项不显著（P＝0.1145），模型总决定系数 R2＝0.980 1，调整后 R2Adj＝0.960 2，以上参数均说明该模型与试验数据拟合程度好，试验误差小，可用于不同变量条件下的响应值预测。

由表3 中 F值可知，金果榄多糖复合酶法提取影响因素主次顺序为：酶解温度（D）＞酶解时间（B）＞酶解 pH 值（A）＞酶添加量（C），其中 D、B 两因素影响显著。因素间交互作用对金果榄多糖得率的影响见图 5，由图 5、表 3 可知，AB、AC、AD、BC交互作用显著影响金果榄多糖酶法提取的得率，其中AB、AD影响极显著，AC、BC显著，BD、CD间交

互作用对多糖得率影响不显著（P＞0.05）。

2.5 最佳提取条件预测及验证试验对回归模型方程求解，获得金果榄多糖复合酶提取的最佳条件为：酶解pH 值 5.1，酶解时间 56.3 min，酶添加量2.0%，酶解温度 52.2 ℃。在此条件下，理论多糖得率为 14.12%。考虑实际操作方便，将上述最佳提取工艺参数修改为：酶解pH 值 5.1，酶解时间

56 min，酶添加量 2.0%，酶解温度 52 ℃。按照该工艺条件进行 3 次验证试验，结果多糖得率平均值为

（14.03±1.25）%，与理论多糖得率的相对误差为

0.64%，提示本法得到的回归模型有效、可靠，该复合酶提取金果榄多糖工艺条件具有实际应用价值。

2.6体外抗氧化活性测定

参照文献[11]方法测定金果榄多糖清除 DPPH 自

由基、O2-•能力，检测波长分别为 517、320 nm。测定金果榄多糖清除•OH 能力的具体步骤按照试剂盒说明书进行，检测波长536 nm。抗氧化活性检测均选择维生素 C 作为对照。样品金果榄多糖及维生素 C的质量浓度梯度设置为 0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、

2.6、3.0 mg/mL。

2.6.1 金果榄多糖对DPPH自由基清除作用金果榄多糖对DPPH自由基清除作用见图6。当金果榄多糖浓度在0.2～3.0 mg/mL时对DPPH自由基清除率稳步提升，浓度为3.0 mg/mL 时，金果榄多糖对 DPPH自由基清除率为 81.96%，维生素 C对 DPPH自由基清除率可达 90.45%，金果榄多糖清除 DPPH

自由基的半数抑制浓度（IC50）为 1.358 mg/mL，维生素C 的 IC50 为 0.867 mg/mL，两者比较，金果榄多糖清除能力弱于维生素C。以上结果提示金果榄多糖具有一定的DPPH自由基清除作用。

2.6.2金果榄多糖对羟自由基清除作用金果榄多糖对羟自由基清除作用见图 7。当金果榄多糖浓度在 0.2～3.0 mg/mL 时对•OH 清除率不断增大，而维生素C在浓度 1.8 mg/mL 时对•OH清除率已接近最大值，之后趋于稳定。当浓度为3.0 mg/mL 时，金果榄多糖对•OH清除率为92.05%，维生素C对•OH清除率为 96.74%，金果榄多糖清除•OH 的 IC50 为

0.927 mg/mL，维生素 C的 IC50 为 0.591 mg/mL，两者比较，维生素C 对•OH清除能力强于金果榄多糖。以上结果提示金果榄多糖具有较好的•OH清除作用。

2.6.3 金果榄多糖对超氧阴离子自由基清除作用金果榄多糖对超氧阴离子自由基清除作用见图8。当金果榄多糖浓度在 0.2～3.0 mg/mL 时对 O2-•清除率稳步提升，浓度为 3.0 mg/mL 时，金果榄多糖对

O2-•清除率为 83.12%，维生素 C 对 O2-•清除率为

91.48%，金果榄多糖清除 O2-•的 IC50 为 1.096 mg/mL，维生素C 的 IC50 为 0.804 mg/mL，两者比较，金果榄多糖对O2-•清除能力弱于维生素C。以上结果说明金果榄多糖具有较好的O2-•清除作用。3 讨论酶法提取中药有效成分操作简单、条件较温和、节约能源、不需要大型设备，并且在成分结构与生物

活性保持方面具有一定的优势[12]。本研究在单因素试验基础上，通过响应面优化设计考察了金果榄多糖复合酶法提取的工艺。结果发现，金果榄多糖最佳酶解提取条件为：酶解pH 值 5.1，酶解时间 56 min，复合酶添加量2.0%，酶解温度 52 ℃，液料比20 mL/g。在此最佳工艺条件下，金果榄多糖得率为 14.03%，与回归模型方程预测值14.12%比较，相对误差＜5%。

4 个影响因素中，酶解温度对金果榄多糖得率的影响最明显，其次是酶解时间和酶解 pH 值，而复合酶添

加量对多糖得率影响最小。赵成刚等[13]采用热水浸提法提取金果榄多糖，在提取时间 1.5 h、提取温度

80 ℃、料液比1∶20、提取 3次的工艺条件下，多糖得率为 13.64%，稍低于本研究中复合酶法提取获得的金果榄多糖得率。本研究选择的酶法提取温度为

52 ℃，明显低于热水浸提法所需的80 ℃，提取温度低在多糖成分结构与活性保持及节能方面具有一定优势。且酶法提取时间也比水提法明显缩短，可在一定程度上提高生产效率。

机体多种疾病如炎症、心脑血管病等的产生均与自由基及其代谢产物诱发机体氧化损伤有关。邓晓

梅[14]研究指出，金果榄总皂苷对•OH、亚硝酸盐、

O2-•的清除能力随其浓度增大而递增。目前有关金果榄多糖抗氧化活性的研究很少见。本研究发现，金果榄多糖对 DPPH 自由基、•OH、O2-•均具有较强的清除能力，且浓度与自由基清除能力呈现一定的正相关关系；但与维生素C比较，金果榄多糖对DPPH 自由基、

•OH、O2-•的清除能力较弱。本研究结果可为金果榄多糖药用价值的开发及其抗氧化活性的深入研究提供一定的依据。

参考文献：

[1] 李一圣,李文周,卫平,等.不同产地金果榄药材中古伦宾含量测定[J].

药学研究,2016,35(6)：328-330.

[2] 王柳卜,贾宪生,陈秀芬,等.金果榄二萜类成分色谱及相关药效学研