清热养阴除湿汤对类风湿关节炎模型大鼠肠道菌群的影响

1，2，张阳利 1，尹圆圆2，张林聪2，郭家彬2，刘密凤 1

张净1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；2.解放军疾病预防控制中心，北京 100071摘要：目的 观察清热养阴除湿汤对类风湿关节炎（RA）模型大鼠炎症因子及肠道菌群的影响。方法 采用胶原诱导建立RA大鼠模型，将成模大鼠随机分为模型组、阳性药组和中药组，另设正常组，每组6只。给药组分别予相应药物灌胃5周。HE染色观察大鼠踝关节组织病理形态，ELISA测定大鼠血清炎症因子转化生长因子（TGF）-β、γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-4、IL-17A含量，采用16S rRNA技术及Illumina高通量基因测序平台对大鼠肠道菌群进行测序分析。结果 与正常组比较，模型组大鼠踝关节软骨局部消失，骨小梁变少、变细，滑膜明显增厚，伴有大量炎性细胞浸润，血清促炎因子IFN-γ、IL-17A含量升高（P< 0.01），抑炎因子TGF-β、IL-4含量降低（P<0.01）；与模型组比较，中药组大鼠踝关节炎性细胞浸润及软骨表面侵蚀减轻，血清IFN-γ和IL-17A含量降低（P<0.01），IL-4和TGF-β含量升高（P<0.01）。肠道菌群测序分析结果显示，清热养阴除湿汤可调节模型大鼠肠道菌群组成结构及丰度，包括降低杆菌属Odoribacter、克里斯滕森菌属 Christensenella、 Povalibacter 属丰度（ P<0.05 ），升高节杆菌属 Arthrobacter、棒杆菌属Corynebacterium、劳尔氏菌属Ralstonia、肠杆菌属 Enterorhabdus和细小杆菌属Parvibacter 丰度（P<0.05）。结论 清热养阴除湿汤可能通过调节炎症因子及与其相关的肠道菌群调节免疫系统，发挥抗炎及骨保护作用。关键词：清热养阴除湿汤；类风湿关节炎；肠道菌群；炎症因子

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2024)05-0068-08 DOI：10.19879/j.cnki.1005-5304.202303668开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Qingre Yangyin Chushi Decoction on Intestinal Flora

in Rheumatoid Arthritis Model Rats

ZHANG Jing1,2, ZHANG Yangli1, YIN Yuanyuan2, ZHANG Lincong2, GUO Jiabin2, LIU Mifeng1

1. Beijing Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100010, China;

2. Chinese PLA Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100071, China

Abstract: Objective To observe the effects of Qingre Yangyin Chushi Decoction on inflammation factors and intestinal flora of rheumatoid arthritis (RA) model rats. Methods The RA model rats were established through collagen. The model rats were randomly divided into model group, positive drug group, and TCM group, and a normal group was set up, with 6 rats in each group. The administration groups were given corresponding drugs by gavage for 5 weeks. The histopathological changes of ankle joint were observed by HE staining; the serum inflammatory factors TGF- β, IFN- γ, IL-4, IL-17A contents were detected by ELISA; 16S rRNA technology and Illumina high-throughput gene sequencing platform were used to sequence and analyze of the structural composition and community differences of intestinal flora. Results Compared with the normal group, the model group rats had local disappearance of ankle joint cartilage, decreased and narrowed bone trabeculae, significantly thickened synovium, and a large amount of inflammatory cell infiltration, serum pro-inflammatory factor IFN-γ and IL-17A contents increased (P<0.01), anti-inflammatory factor TGF-β and IL-4 contents decreased (P<0.01). Compared with the model group, inflammatory cell infiltration and cartilage surface erosion were reduced in the ankle joint of rats in the TCM group, serum IFN-γ and IL-17A contents were reduced, and TGF-β and IL-4 contents increased (P<0.01).基金项目：北京市自然科学基金面上项目（7172101）；首都医科大学附属北京中医医院科技发展基金（LYYB202222）通讯作者：刘密凤，E-mail：hydgwxy@126.com

The sequencing analysis of intestinal flora showed that Qingre Yangyin Chushi Decoction could regulate the composition and abundance of intestinal flora in model rats, including decreasing the abundance of Odoribacter, Christensenella, and Povalibacter (P<0.05), increasing the abundance of Arthrobacter, Corynebacterium, Ralstonia, Enterorhabdus and Parvibacter (P<0.05). Conclusion Qingre Yangyin Chushi Decoction may regulate the immune system by regulating inflammatory factors and their associated intestinal flora, exerting anti-inflammatory and osteoprotective effects.

Keywords: Qingre Yangyin Chushi Decoction; rheumatoid arthritis; intestinal flora; inflammatory factors

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的自身免疫性疾病，具有浸润性滑膜炎、血管翳形成和关节软骨破坏的病理特征。临床主要表现为对称性、多个周围关节的慢性炎性病变，关节僵硬、慢性疼痛，进一步发展可导致关节畸形、功能障碍甚至残疾。肠道微生物从宿主汲取营养，同时通过各种方式调节宿主的消化吸收、物质代谢，防止病原菌入侵并调节机体免疫系统，对维持机体健康发挥重要作用[1-3]。越来越多研究表明，肠道菌群与RA发病关系密切[4-5]，通过调节菌群失调可减轻RA炎症和骨破坏[6-7]。清热养阴除湿汤为首都医科大学附属北京中医医院风湿科王为兰教授临床经验方，由半枝莲、虎杖、金银花、连翘等10余味中药组成，全方具有清热解毒、化浊除湿、通督止痛功效，最早用于RA急性期治疗，后逐渐推广用于强直性脊柱炎、痛风性关节炎等多种疾病急性期[8]。前期研究显示，其抗炎、镇痛作用良好[9]。本研究观察清热养阴除湿汤对RA模型大鼠炎症因子及肠道菌群的影响，探讨其治疗RA的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

6～8周龄SPF级Wistar大鼠24只，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物生产许可证号 SCXK （京） 2018-0006 ，质量合格证号1100111911046320。饲养于温度（ 24±2）℃、湿度60%～70%环境，每日12 h光照，自由摄食饮水，适应性饲养1周。本实验经首都医科大学附属北京中医医院伦理委员会审批（2019100102）。

1.2 药物与试剂

清热养阴除湿汤由白花蛇舌草、金银花、连翘、半枝莲、虎杖、生地黄、熟地黄、土茯苓、制川乌、白芍、白鲜皮、桂枝、忍冬藤组成，饮片购于首都医科大学附属北京中医医院，由制剂室统一制成煎剂，置于4℃保存备用。甲氨蝶呤（MTX），上海上药信谊药厂有限公司，货号H31020644。将药片研碎后，用生理盐水配制成浓度为0.062 5 mg/mL混悬液。

弗氏不完全佐剂（FIA），美国Chondrex公司，货

Ⅱ

号 7002 ；牛 型胶原，美国 Chondrex 公司，货号20022；转化生长因子（TGF）-β、γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-4、IL-17A检测试剂盒，北京冬歌博业生物科技有限公司，货号分别为DG20110D、DG20066D、DG94488Q、DG94480Q；DNA提取试剂盒，美国Omega公司，货号M5635-02；2×Taq Master Mix，南京诺唯赞公司，货号P111-03；细菌16S rRNA V3～V4区域通用引物，上海生工生物工程公司。

1.3 仪器

ABI 7500 PCR仪（美国Life公司），Qubit 2.0荧光定量仪（美国Life公司），Hiseq 2500测序仪（美国Illumina 公司），2500型凝胶成像仪（上海Tanon 公司），2100型生物分析仪（美国Aglient公司），FM50型制冰机（北京长流科学仪器有限公司），MDF-U53V低温冰箱（SANYO），5417R台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司），PL403型电子天平（梅特勒-托勒多上海有限公司），FSH-2A型高速匀浆机（常州市亿能实验仪器厂），Milli-QA10 Academic超纯水仪（美国Millipore）。

2 实验方法

2.1 造模将等体积牛Ⅱ型胶原与

FIA在冰浴上用高速匀浆机（约15 000 r/min）充分混匀制备成乳剂，并于制备后1h内使用。参照文献[10]采用胶原诱导建立RA模

μg/只）进行型：大鼠尾部皮下注射0.2 mL乳剂（200

μg/只）加初次免疫，7d后再次注射0.1 mL乳剂（100强免疫。正常组于相同部位注射等量生理盐水。初次免疫第14日开始，每周观察大鼠四肢关节病变程度，进行关节炎指数评分，连续观察6周。评分标准：0分，正常；1分，小趾红肿；2分，趾关节和足跖肿胀；3分，踝关节以下足爪肿胀；4分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀。各关节评分累计得出每只大鼠关节炎指数评分。初次免疫第14日，关节炎指数评分>4分的大鼠为成模大鼠。

2.2 分组及给药

将18只成模大鼠随机分为模型组、阳性药组和中