CJI (Traditional Chinese Medicine)
基于肠道菌群和代谢组学探讨抵当芪桂汤改善大鼠2型糖尿病作用机制
1.陕西中医药大学基础医学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西 咸阳 712083摘要：目的 基于肠道菌群和代谢组学探讨抵当芪桂汤治疗2型糖尿病（T2DM）的可能作用机制。方法 采用高糖高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素诱导T2DM大鼠模型，将大鼠分为空白对照组、模型组、二甲双胍组和中药低、中、高剂量组，每组10只，给药组分别予相应药液灌胃6周。测定大鼠空腹血糖（FBG）及血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶酶（ALT）含量， HE染色观察大鼠胰腺组织、结肠组织形态，16S rRNA测定肠道微生物群落组成及相对丰度，非靶向代谢组学对血清代谢物进行分析，采用正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）筛选潜在差异代谢物，MetaboAnalyst5.0平台分析代谢物的代谢通路，对肠道菌群及血清代谢结果进行联合分析。结果 与空白对照组比较，模型组大鼠体质量显著降低，FBG显著升高，血清TG、TC、LDL-C、ALT、AST含量显著升高（P<0.01）；胰岛结构严重萎缩变形、边界模糊不清，胰岛细胞排列紊乱，部分出现空泡变性，核碎裂或溶解消失；结肠结构破坏明显，上皮细胞脱落，炎性细胞浸润。与模型组比较，中药低、中、高剂量组大鼠FBG显著降低，血清TG、TC、LDL-C、AST、ALT含量显著降低（P<0.01），胰岛形态不同程度改善，结肠组织炎性细胞浸润减轻。16S rRNA测序nd结果显示，抵当芪桂汤可调节T2DM大鼠肠道菌群结构，提高Chao1、observed_species、PD-whole-tree、Simpson谱系多样性指数，上调厚壁菌门、放线菌门等相对丰度，下调拟杆菌门相对丰度，增加乳杆菌属、双歧杆菌属、Lachnoclostridium属等益生菌相对丰度。血清代谢组学分析共筛选出1-十四酰-2-羟基卵磷脂、N-甲基烟酰胺、乳清酸、丙氨酸、D-甘露糖等12个潜在差异代谢物，涉及D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢、嘧啶代谢4条代谢通路。相关性分析发现，考拉杆菌属、拟杆菌属、Romboutsia
属和拟普雷沃氏菌属与血清差异代谢物密切相关。结论 抵当芪桂汤对大鼠T2DM具有改善作用，其机制可能与调节肠道菌群、改变血清代谢物有关。
关键词：2型糖尿病；抵当芪桂汤；肠道菌群；代谢组学；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2024)05-0076-09 DOI：10.19879/j.cnki.1005-5304.202311444 开放科学（资源服务）标识码（OSID）： Exploration on the Mechanism of Didang Qigui Decoction in Improving Type 2 Diabetes Mellitus in Rats Based on Intestinal Flora and Metabolomics
CHENG Du1, GUO Yijia1, ZHANG Xiao1, LEI Liyan2, LIANG Yanni2, WANG Zheng2, YANG Jingfeng1
1. College of Basic Medical Science, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China; 2. Collaborative Innovation Center for Chinese Medicinal Resources Industrialization by Shaanxi Province, Xianyang 712083, China Abstract: Objective To investigate the possible mechanism of Didang Qigui Decoction in the treatment of type 2 diabetes mellitus (T2DM) based on intestinal flora and metabolomics. Methods T2DM rat model was induced by high sugar and high fat diet combined with STZ intraperitoneal injection. The rats were divided into blank control基金项目：陕西省重点产业创新链项目（2018ZDCXL-SF-01-02-02）；陕西高校青年科技创新团队（2019年）；陕西省教育厅重点科学研究计划（20JY011、20JY012）通讯作者：杨景锋，E-mail：yangjingfeng1970@126.com
group, model group, Metformin group, Didang Qigui Decoction low-, medium- and high-dosage groups, with 10 rats in each group. The medication groups was given corresponding medicine for gavage for 6 weeks. The fasting blood glucose (FBG) and total cholesterol (TC), total triglycerides (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), highdensity lipoprotein cholesterol (HDL-C), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) in serum were determined. HE staining was used to observe pancreatic and colon tissue morphology in rats. 16S rRNA was used to determine the composition and relative abundance of gut microbiota, and non-targeted metabolomics was used to analyze serum metabolites. Orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) was used to screen for potential differential metabolites, MetaboAnalyst 5.0 platform was used to analyze metabolic pathways of metabolites, and perform joint analysis on gut microbiota and serum metabolism results. Results Compared with the blank control group, the model group showed a significant decrease in body mass, a significant increase in FBG, and a significant increase in serum TG, TC, LDL-C, ALT and AST contents (P<0.01); the structure of pancreatic islets was severely atrophied and deformed, with unclear boundaries, disordered arrangement of pancreatic islet cells, partial vacuolar degeneration, nuclear fragmentation or dissolution disappearance; the colon structure was significantly damaged, with epithelial cells shedding and inflammatory cells infiltrating. Compared with the model group, the FBG of rats in the Didang Qigui Decoction low-, medium- and high-dosage groups were significantly decreased, and the contents of serum TG, TC, LDL-C, AST and ALT were significantly decreased (P<0.01); the morphology of pancreatic islets was improved to varying degrees, and inflammatory cell infiltration in colon tissue was reduced. The 16S rRNA sequencing results showed that Didang Qigui Decoction could regulate the gut microbiota structure of T2DM rats, increase the diversity index of Chao1, observed_species, PD-whole-tree, and Simpson index, up-regulate the relative abundance of Firmicutes and Actinobacteria, down-regulate the relative abundance of Bacteroidetes, and increase the relative abundance of probiotics such as Lactobacillus, Bifidobacterium, and Lachnochlosterium. Serum metabolomics analysis identified 12 potential differential metabolites, including 1-tetradecyl-2-hydroxylecithin, N-methylnicotinamide, whey acid, alanine, and D-mannose, involving four metabolic pathways: D-arginine and D-ornithine metabolism, phenylalanine metabolism, glycerophospholipid metabolism, and pyrimidine metabolism. Correlation analysis found that the Phascolarctobacterium, Bacteroidetes, Romboutsia, and Alloprevotella were closely related to serum differential metabolites. Conclusion Didang Qigui Decoction has the effect of improving T2DM in rats, and the mechanism may be related to the regulation of intestinal flora, alteration of serum metabolites.
Keywords: type 2 diabetes mellitus; Didang Qigui Decoction; intestinal flora; metabolomics; rats 2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是
β由外周胰岛素抵抗和胰岛 细胞功能缺陷形成的以高血糖为主要病理表现的慢性代谢性疾病[1]。随着现代生活
方式的改变，T2DM发病趋于年轻化，不良生活习惯如饮食不节、作息紊乱、缺乏运动等为其重要诱因。T2DM属中医学“消渴病”范畴。陕西中医药大学杨景锋教授根据多年临证经验，将黄芪桂枝五物汤与抵当汤化裁成抵当芪桂汤，研究发现，该方能有效降糖降脂、保护大鼠胰岛细胞功能、改善机体代谢及慢性炎症、延缓T2DM及其并发症发生发展[2-4]，但其作用机制尚不清楚。
研究表明，肠道微生物群变化与胰岛素敏感性[5]和脂质代谢[6]关系密切，中药通过调节肠道菌群改善代谢相关疾病的潜在治疗机制也逐渐被发现[7]。血清中脂肪
酸、胰岛素原、炎症因子、脂质、脂蛋白和氨基酸等
代谢物亦与T2DM发生发展关系密切[8]。本研究从肠道菌群及血清代谢组学角度探究抵当芪桂汤治疗T2DM的作用机制，为该方应用与开发提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
8周龄SPF级雄性SD大鼠75只，体质量180～ 220 g，购自四川成都达硕动物技术有限责任公司，动物生产许可证号SCXK（川）2020-030，动物合格证号0043962。大鼠饲养于陕西省中药资源产业化协同创新中心SPF级动物实验室，温度20～26 ℃，相对湿度40%～70%，明暗周期12 h/12 h，自由饮水摄食。饲养期间遵循陕西中医药大学实验动物管理和使用规定，本实验经陕西中医药大学实验动物伦理委员会审批（SUCMDL20221011003）。
1.2
主要药品及试剂抵当芪桂汤由黄芪30 g、桂枝10 g、炒白芍10 g、酒大黄10 g、水蛭6g、鬼箭羽20 g组成，饮片由陕西兴盛德药业有限责任公司提供，批号分别为20220102、20220201、20211203、20220301、170101、20220401。按用量取饮片混匀，加10倍量水浸泡35 min，大火煮沸后文火煎煮30 min，过滤，药渣加5倍量水煎煮30 min，合并滤液，旋转蒸发仪浓缩至原药材浓度为1 g/mL药液。盐酸二甲双胍片，规格0.5 g/片，中美上海施贵宝制药有限公司，批号 ACG0103、ACF0565。将0.5 g盐酸二甲双胍片粉碎，溶于100 mL超纯水中过夜溶胀，即得0.5%盐酸二甲双胍混悬液，取5片盐酸二甲双胍片粉碎，溶解于100 mL混悬液中，即得浓度为25 mg/mL二甲双胍混悬液。
1.3 主要试剂与仪器
链脲佐菌素（STZ），纯度98%，德国Sigma公司，批号WXBD7906V；柠檬酸钠缓冲液，福州Phygene公司，批号PH1716；DNA提取试剂盒，美国Omega Bio-Tek公司，批号D5625-01；Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒，美国 Beckman Coulter ，货号
Ⅱ A63880/1/2；NEBNext Ultra DNA文库制备试剂盒，美国New England Biolabs，货号E7630S。鱼跃血糖仪及配套采血针、试纸，江苏鱼跃凯立特生物科技有限公司，型号悦准Ⅰ型
710；光学显微镜及配套显微镜照相系统，日本Olympus，型号BX-53；千分之一天平、十万分之一电子天平，德国梅特勒-托利多仪器有限公司，型号PL3O3、MS105DU ；超低温冰箱，美国Thermo Fisher Scientific，型号ULTS386；超微量分光光度计，美国 Thermo Fisher Scientific ，型号NanoDrop 2000；电泳仪，北京市六一仪器厂，型号DYY-6C； PCR 扩增仪，美国 ABI 公司，型号GeneAmp 9700；高通量测序仪，美国Illumina，型号DX-410-1001 ；超高效液相色谱仪，美国 Thermo Fisher Scientific，型号Acquish；高分辨质谱仪，美国Thermo Fisher Scientific，型号Q Exactive HFX；研磨仪，上海净信科技有限公司，型号SCIENTZ-48；纯水仪，德国Merck Millipore，型号Integral 15；超声仪，宁波新芝，型号SB25-12D；超微量紫外可见分光光度计，美国Thermo Fisher Scientific，型号NanoDrop One。2 实验方法
2.1 造模
大鼠适应性喂养7d后，采用随机数字表法分为空白对照组（10只）和高脂饲料组（65只），空白对照组予基础维持饲料，高脂饲料组予高糖高脂饲料（基础维持饲料67%、猪油10%、胆固醇2%、胆酸钠1%、蔗糖20%），饲养4周后，禁食12 h，高脂饲料组腹腔注射STZ 35 mg/kg，空白对照组腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液。72 h后尾静脉采血检测空腹血糖（FBG），
FBG≥11.1
以 mmol/L为标准，未达标大鼠再次注射相同剂量STZ。注射后1、2周再次尾静脉采血检测FBG，
FBG≥11.1
3次测量 mmol/L则表明T2DM大鼠模型制备成功。本实验成模率为77%。
2.2 分组及给药
将50只成模大鼠随机分为模型组、二甲双胍组和中药低、中、高剂量组，每组10只。中药低、中、高剂量组按成人（70 kg）临床剂量的0.5、1、2倍量给药，分别予3.87、7.74、15.48 g/kg抵当芪桂汤药液灌胃，二甲双胍组予盐酸二甲双胍混悬液250 mg/kg灌胃，灌胃体积1 mL/100 g，空白对照组和模型组予等体积生理盐水，连续6周。为维持模型稳定，给药期间继续予高糖高脂饲料喂养。
2.3 体质量及空腹血糖
给药前大鼠禁食12 h，称量体质量，采血针尾静脉采血，血糖仪测量FBG，每只大鼠测量3次，计算平均值，作为初始数据。每周重复上述操作，记录大鼠体质量和FBG，绘制体质量及FBG变化曲线。
2.4血清生化检测
给药结束后，大鼠禁食不禁水12 h，2%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，采血后脱颈处死。全血室温放置30～40 min，4℃、3 500 r/min离心10 min，取上清液，采用生化仪检测血清总胆固醇（ TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）含量。2.5 病理观察
取血后分离大鼠胰腺及结肠组织，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，二甲苯透明后，光学显微镜下观察结肠组织炎症情况及胰岛细胞变性坏死情况，并用cellSens Entry 1.11显微镜照相系统拍照[9]。
2.6 16S rRNA测序分析
给药结束后处死大鼠，取肠道无菌粪便2～3粒放入冻存管中，使用DNA提取试剂盒提取粪便样本基因组DNA，分光光度计检测DNA质量和浓度。通用引物338F （5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' ）和806R （5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）扩增细菌16S rRNA基因V3～V4区，在上下游引物的5'端各添加8 bp的barcode序列，以区分不同样本。最后合成
带有barcode序列的通用引物在PCR仪上进行扩增，使用1%琼脂糖凝胶电泳（170 V、30 min）检测扩增目的条带大小，所得产物使用Agencourt AMPure XP核
Ⅱ酸纯化试剂盒进行自动纯化，再用NEBNext Ultra DNA文库制备试剂盒进行文库构建，质检后在Illumina Miseq测序平台进行测序。数据拆分拼接后，过滤短序列，去除嵌合体，对优质序列进行操作分类单元（OTUs）聚类，与数据库进行比对，得到每个OTU对应的物种分类信息，基于OTUs及其丰度结果
α
进行 多样性分析、物种组成分析及线性判别分析（LEfSe），找出组间有显著差异的微生物。
2.7 非靶向血清代谢组学分析
μL μL
取50 血清至EP管中，加入200 提取液（甲醇∶乙腈=1∶1，含同位素标记内标混合物），涡旋混匀30 s，冰上超声10 min，-40 ℃静置1 h，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液于进样瓶中上机检测，另取等量所有样品上清液混合成质控（QC）样品上机检测。
色谱条件：ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱μm，2.1
（1.7 mm×100 mm），流动相为25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L氨水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～1 min， 95%A； 1～12 min， 95%～5%A； 12～ 13.5 min，5%A；13.5～13.6 min，5%～95%A；13.6～ 16 min，95%A），流速0.3 mL/min，自动进样器温度4℃，进样体积2 µL。质谱条件：①正离子模式。加热器温度
350 ℃，鞘气流速30 arb，辅助气流速25 arb，尾气流速1 arb，电喷雾电压3.6 kV，毛细管温度350 ℃，S-Lens RF Level 30%。②负离子模式。加热器温度
300 ℃，鞘气流速45 arb，辅助气流速15 arb，尾气流速1 arb，电喷雾电压-3.2 kV，毛细管温度350 ℃，S-Lens RF Level 60%。
使用 ProteoWizard软件将质谱原始数据转换成mzXML格式，XCMS进行保留时间校正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等操作，通过R程序包和自建二级质谱数据库对峰进行鉴定，并对原始数据进行缺失值模拟、标准化处理，对处理后的数据进行多元变量模式识别分析，包括主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA），以差异倍数（FC）、变量重要性投影（VIP）值和P值筛选潜在差异代谢物，通过MetaboAnalyst5.0平台分析代谢物的代谢通路[10-12]。
3统计学方法
采用SPSS25.0统计软件进行分析。计量资料符合
xˉ±s
正态分布以 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 抵当芪桂汤对模型大鼠体质量及空腹血糖的影响
给药前，与空白对照组比较，各组大鼠体质量显著降低，FBG显著升高（P<0.01）。给药后，空白对照组体质量持续增加，其余组大鼠体质量呈缓慢下降趋势，模型组体质量下降最明显。与模型组比较，各给药组大鼠体质量无明显变化（P>0.05），FBG缓慢下降，给药4周，二甲双胍组FBG显著下降（P<0.05）；给药5周，中药高剂量组大鼠FBG显著下降（P< 0.01）；给药6周，各给药组大鼠FBG均显著下降（P< 0.01）。见图1。
注：与空白对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
变化（xˉ±s，每组
图1各组大鼠不同时点体质量及FBG 6只） 4.2 抵当芪桂汤对模型大鼠血脂和肝功能的影响与空白对照组比较，模型组大鼠血清TG、TC、LDL-C、ALT、AST含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，中药低剂量组大鼠血清AST、ALT、LDL-C含量显著降低（P<0.01），中药中剂量组TC、LDL-C、AST、ALT含量显著降低（P<0.01），中药高剂量组TG、TC、LDH-C、AST、ALT含量显著降低（ P< 0.01），二甲双胍组TG、TC、LDH-C、AST、ALT含量均显著降低（P<0.01），各给药组HDL-C含量有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
注：与空白对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01
4.3 抵当芪桂汤对模型大鼠胰腺组织和结肠组织形态的影响
空白对照组大鼠胰腺小叶内腺泡均匀、排列整齐，胰岛分布在腺泡间、结构完整，胰岛细胞簇呈卵圆形，边界清晰，胰岛细胞数量丰富、形态规则、分布均匀；模型组大鼠外分泌腺腺泡大小不均、排列紊乱，胰岛结构严重萎缩变形、边界模糊不清，胰岛面积减小，胰岛细胞排列紊乱，部分胰岛细胞出现空泡变性，伴随核碎裂或溶解消失；与模型组比较，中药低剂量组部分腺泡细胞形态恢复、排列较整齐，胰岛结构萎缩变形、边界模糊，但胰岛面积增大，胰岛细胞仍排列紊乱；中药中、高剂量组和二甲双胍组胰腺病理状态明显改善，外分泌腺排列较整齐，胰岛结构较完整，边界较清晰，胰岛细胞数量增多，形态较规则、饱满。见图2。
图2 各组大鼠胰腺组织形态（HE染色，标尺=50 μm）空白对照组大鼠结肠浆膜层、肌层、黏膜下层、黏膜层等结构清晰可见，隐窝排列整齐紧密，数量众多，杯状细胞丰富，黏膜表面覆有大量绒毛，上皮细胞无明显变性脱落；模型组大鼠结肠层级结构破坏明显，上皮细胞脱落，炎性细胞浸润，隐窝细胞受损，肠腺体结构消失，通透性增加；中药低、中、高剂量组大鼠肠黏膜上皮较完整，部分上皮细胞脱落变性，部分组织可见少量炎性细胞浸润，隐窝细胞恢复，腺体结构排列整齐；二甲双胍组大鼠结肠浆膜层、肌层、
黏膜下层、黏膜层等结构清晰可见，隐窝排列整齐，数量较多，上皮细胞未见明显脱落。见图3。4.4 抵当芪桂汤对模型大鼠肠道菌群的影响
4.4.1 肠道菌群物种注释
本研究选择中药中剂量组进行后续肠道菌群相关研究。16S rRNA测序结果显示，聚类共获得3 126个OTUs，经抽平处理剩余3 105个，3组间共同OTUs 1 861个，占59.9%，空白对照组、模型组和中药中剂量组分别有2 932、2 310、2 348个OTUs，中药中剂量组OTUs高于模型组。
4.4.2 α多样性分析α多样性可反映微生物群落的丰度和多样性， Chao1即菌群丰富度指数，用以估计群落中的OTU数目；observed_species指随测序深度增加，是实际观测到的OTU个数；PD_whole_tree为谱系多样性指数，兼顾考虑了物种丰度及进化距离的多样性；Simpson除用来估算样品中微生物多样性外，还兼顾丰富度和均匀度。结果显示，与空白对照组比较，模型组Chao1、observed_species、PD_whole_tree 及 Simpson 指数下降，说明T2DM对肠道菌群物种数量及多样性有显著影响；与模型组比较，中药中剂量组 Chao1、observed_species、 PD_whole_tree 指数显著升高， Simpson指数也有所上升，表明抵当芪桂汤可增加模型大鼠肠道菌群丰度及多样性。见图4。
图4各组大鼠肠道菌群α多样性比较
4.4.3组成变化分析
在门水平上，各组大鼠肠道菌群主要包括厚壁菌门 Firmicutes、拟杆菌门 Bacteroidota、脱硫杆菌门Desulfobacterota、放线菌门Actinobacteriota和变形菌门Proteobacteria等，其中厚壁菌门和拟杆菌门是优势门，占各组相对丰度95%以上。与空白对照组比较，模型组大鼠厚壁菌门、脱硫杆菌门和放线菌门相对丰度分别减少28%、26%、56%，拟杆菌门和变形菌门相对丰度分别增加15%和17%；与模型组比较，中药中剂量组厚壁菌门和放线菌门丰度分别增加4%和364%，表明抵当芪桂汤能调节T2DM大鼠肠道菌群相对丰度。见图5A。
各组大鼠肠道菌群相对丰度较高的属分别是普雷沃氏菌属 Prevotella、乳杆菌属 Lactobacillus、Muribaculaceae属、Lachnospiraceae_NK4A136_group属、考拉杆菌属 Phascolarctobacterium、Prevotellaceae_UCG-001 属、拟普雷沃氏菌属Alloprevotella、拟杆菌属Bacteroides等，其中普雷沃氏菌属、乳杆菌属和 Lachnospiraceae_NK4A136_ group属是优势菌属。与空白对照组比较，模型组大鼠普雷沃式菌属、考拉杆菌属和拟杆菌属相对丰度分别增加62%、98%和97%，Muribaculaceae属、乳杆菌属和异杆菌属Allobaculum相对丰度分别减少37.5%、32.8%和68.5%；与模型组比较，中药中剂量组乳杆菌属、Lachnoclostridium属、异杆菌属、双歧杆菌属Bifidobacterium、UCG-005、经黏液真杆菌属Blautia相对丰度分别增加55.7%、19.6%、434%、453%、49%、37%，考拉杆菌属、拟杆菌属、瘤胃球菌属4.4.4 物种差异判别分析
采用LEfSe确定各组属水平贡献最大的特定菌群。与空白对照组比较，模型组大鼠普雷沃氏菌属、考拉杆菌属及拟杆菌属等 45 个菌属丰度上调， Muribaculaceae属、乳杆菌属、拟普雷沃氏菌属、Lachnoclostridium属、异杆菌属、双歧杆菌属等73个菌属丰度下调；与模型组比较，中药中剂量组乳杆菌属、Lachnoclostridium属、异杆菌属、双歧杆菌属、UCG-005等44个菌属丰度上调，其中乳杆菌属、异杆菌属、双歧杆菌属、Lachnoclostridium属丰度显著上调（P<0.05），考拉杆菌属、拟杆菌属及Romboutsia属等29个菌属丰度下调。
4.5 抵当芪桂汤对模型大鼠血清代谢物的影响
4.5.1 主成分分析
PCA用来观察组间样本的总体分布趋势和差异度。结果显示，空白对照组组间差异较小，总体分布趋势一致，模型组组间差异较大，样本分散，中药中剂量组和模型组组成轮廓有部分重叠，中药中剂量组组间差异更小，总体分布趋势相似，且与模型组有分离趋势。PCA得分图见本文OSID码。
4.5.2 正交偏最小二乘-判别分析
OPLS-DA是一种有监督的判别分析统计方法，该方法运用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型，可最大程度反映组间差异，从中筛选出与分组相关的差异代谢物。结果显示，空白对照组和模型组样本分离明显，模型参数R2X=0.558， R2Y=0.99，模型预测参数Q2=0.927；中药中剂量组和模型组样本可分离，模型参数R2X=0.56，R2Y=0.996，模型预测参数Q2=0.669。Q2>0.5表示模型有效，说明该模型数据有效可靠。OPLS-DA得分及模型验证结果见本文OSID码。4.5.3 潜在差异代谢物筛选
FC≥2 FC≤0.5、P<0.05、VIP≥1以 或 为筛选标准，找出模型组与空白对照组的差异代谢物，分析其在3组中的变化，中药中剂量组呈现明显向空白对照组回调的成分即为潜在差异代谢物，共筛选出12个潜在差异代谢物，见表2。4.5.4 代谢通路分析
将12个潜在差异代谢物输入MetaboAnalyst5.0平台进行代谢通路分析，共筛选出4条代谢通路，分别为D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢、嘧啶代谢。
4.6 肠道菌群和代谢组学综合分析
为明确血清代谢物与肠道菌群间的相互作用，对12个差异代谢物及普雷沃氏菌属、Muribaculaceae属、乳杆菌属、拟普雷沃氏菌属、Lachnoclostridium属、异杆菌属、双歧杆菌属等14个关键菌属进行Spearman相关性分析（见图6），结果发现，部分血清代谢物与肠道菌群存在显著相关性。其中考拉杆菌属与丙氨酸呈负相关，拟杆菌属与D-鸟氨酸、D-甘露糖、苯甲酰甘氨酸、丙氨酸、乳清酸呈负相关，Romboutsia属与12-羟基二十碳四烯酸、阿雷卡丁、乙酰甘氨酸呈负相关，与N-棕榈酰神经鞘氨醇呈正相关，拟普雷沃氏菌属与D-甘露糖、苯甲酰甘氨酸、阿雷卡丁呈正相关。5 讨论
杨景锋教授认为，T2DM病位在脾，脾主运化，五味为甘，是体内物质代谢的枢纽，脾虚失运，水谷不能化生精微布散周身，结聚脾胃，痰湿内生，甘无以化生、布散导致体内糖分蓄积，由于脾气虚运血无力，血行不畅，滞而成瘀。两因相合，痰湿内生，甘无以化，络脉失养，气血失司，进而导致T2DM发生。抵当芪桂汤方中以黄芪为君，补脾肺肾，益气以行血；桂枝为臣，可通行血脉；佐炒白芍养阴，补肝体、助肝用，使肝能疏泄而助脾运化，酒大黄、水蛭、鬼箭羽三药并使，化瘀通络兼祛除湿浊。诸药合用，共奏通络降糖、益气化瘀之功。
肠道菌群对机体的物质和能量代谢产生重大影
响[13]。研究表明，多种疾病与肠道菌群失调有关[14-20]。
T2DM既是一种复杂的代谢性疾病，也是一种慢性低度炎症性疾病，并伴有高水平的循环促炎细胞因子释放。促炎因子会影响葡萄糖代谢和胰岛素信号，破坏
肠黏膜屏障通透性[21]；高糖高脂可引起肠道炎症，导
致肠道屏障功能受损，加快病原微生物和内毒素入侵[22]，增加T2DM患病率。研究发现，在门水平上，糖尿病大鼠肠道菌群由厚壁菌门向拟杆菌门富集[23]，拟杆菌门和变形菌门丰度显著增加[24]；在属水平上，瘤胃球菌属、梭杆菌属和蓝褐藻菌属与T2DM发生发展呈正相关，而双歧杆菌属、拟杆菌属、粪杆菌属、罗斯菌属与T2DM呈负相关[25]。与正常人相比，糖尿病患者梭菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌丰度降低，多尔氏菌属、链球菌属、瘤胃球菌属丰度增加，而厚壁菌门、梭状芽孢杆菌纲、拟杆菌属、双歧杆菌属丰度明显减
少[26]。药理研究表明，肠道有益菌通过产生短链脂肪酸、调节胆汁酸代谢、调节机体炎症反应、减少内毒素、影响机体内分泌调节等机制干预糖尿病[20，25]。本
研究结果显示，抵当芪桂汤通过上调T2MD大鼠放线菌门、厚壁菌门丰度，下调拟杆菌门丰度，增加有益菌乳杆菌属、异杆菌属、双歧杆菌属、Lachnoclostridium属等丰度，减少考拉杆菌属、拟杆菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌等菌属丰度，调节T2DM大鼠肠道菌群结构，降低大鼠血糖、血脂水平，减轻胰腺和结肠组织病理损伤，修复肠道屏障。乳杆菌、双歧杆菌等益生菌还可通过降低T2DM大鼠丙二醛和活性氧水平、增加抗氧化酶水平，调节胰岛素分泌，达到降糖效果[27]。
本研究通过血清代谢组学方法筛选出12个与抵当芪桂汤治疗T2DM有关的潜在差异代谢物，涉及D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢及嘧啶代谢。抵当芪桂汤干预后，1-十四酰-2-羟基卵磷脂、D-鸟氨酸、N-甲基烟酰胺、乳清酸、丙氨酸、D-甘露糖等代谢物较模型组回调并接近空白对照组。有研究发现，1-十四酰-2-羟基卵磷脂是一种溶血磷脂，参与甘油磷脂代谢途径，通过作用于溶血磷脂受体在脂质信号传导中发挥作用，具有多种保护和抗炎作
用[28]。甘露糖、乳清酸、丙氨酸、苯甲酰甘氨酸等是
嘧啶代谢过程的中间物或产物，D-甘露糖可通过竞争性抑制具有免疫作用的结合凝集素防止FimH介导的细菌黏附在尿路中，有效减少尿路感染[29]，并可调节免疫系统、促进伤口愈合、抗炎[30]、抑制肿瘤生长[31]等。乳清酸又称维生素B13，作为一种营养补充剂被广泛应用于药物和动物饲料，是很好的保肝药，对黄疸性肝病、脂肪肝等急慢性肝炎有较好疗效。丙氨酸是人体
重要氨基酸，可作为神经递质或激素调节器，调控体
内新陈代谢[32]，作为运动增强剂被广泛应用于临床，具有良好的抗疲劳效果[33]。本研究发现，抵当芪桂汤干预可使T2DM大鼠代谢物向空白对照组回调，其机制可能与D-鸟氨酸、乳清酸、丙氨酸、D-甘露糖等代谢物及参与的代谢通路有关。同时，血清代谢物与肠道菌群的相关性分析表明，考拉杆菌属、拟杆菌属、Romboutsia属和拟普雷沃氏菌属与4种代谢途径的相互作用可能是抵当芪桂汤治疗T2DM的重要机制。
综上所述，抵当芪桂汤可改善高脂高糖饮食联合STZ注射引起的T2DM大鼠胰腺和结肠组织病理形态，修复和保护肠道，可能通过调节肠道菌群组成和相对丰度及血清代谢物发挥对T2DM的保护作用。参考文献：
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（收稿日期：2023-11-21） （修回日期：2024-02-17；编辑：郑宏）