基于Wnt/β-catenin/TRPC6/CaN通路探讨淫羊藿苷对激素抵抗性肾病综合征大鼠泼尼松抵抗的作用机制

1.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730020；2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730020摘要：目的 观察淫羊藿苷对激素抵抗性肾病综合征（SRNS）大鼠泼尼松抵抗的改善作用，及对Wnt/ β-catenin/TRPC6/CaN通路表达的影响。方法 将50只SD大鼠分为空白组、模型组、泼尼松组（6.3 mg/kg）、淫羊藿苷组（50 mg/kg）和联合组，每组10只。采用2次尾静脉注射阿霉素建立SRNS大鼠模型，分别予相应方式干预6周。观察大鼠一般状态，检测24 h尿蛋白定量（24 h-UTP）、尿17-羟皮质类固醇（17-OHCS）及血清生化指标，Masson染色观察肾组织病理形态及超微结构，RT-PCR、Western blot检测肾组织Wnt/β-catenin/ TRPC6/CaN通路相关基因及蛋白表达。结果 与空白组比较，模型组大鼠体质量、进食量、饮水量均明显减少，24 h-UTP增加、尿17-OHCS含量减少（P<0.01），血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）含量升高（P<0.01），血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）含量降低（P<0.05，P< 0.01）；肾小球增大，基底膜增厚，球囊壁增厚伴纤维化，足细胞空泡变性，有大量胶原纤维沉积，胶原容积分数（CVF）增加（P<0.01）；Wnt、β-catenin、TRPC6、CaM、CaN、NFAT1 mRNA和蛋白表达均明显升高（P<0.01），F-actin、MYH9 mRNA和蛋白表达明显降低（P<0.01）。与模型组比较，联合组大鼠体质量、饮水量明显增加，24 h-UTP降低、尿17-OHCS含量增加（P<0.01），SCr、BUN、TG含量降低（P<0.01）；肾组织纤维化程度减轻，CVF减少（P<0.01），足突融合现象明显好转，足细胞结构趋于正常；肾组织Wnt、β-catenin、TRPC6、CaM、CaN、NFAT1 mRNA和蛋白表达明显降低，F-actin、MYH9 mRNA和蛋白表达明显升高（P< 0.01，P<0.05）。结论 淫羊藿苷可能通过抑制Wnt/β-catenin/TRPC6/CaN通路，上调骨架蛋白F-actin、MYH9基因和蛋白表达，进而保护足细胞结构、减缓足细胞损伤，改善SRNS大鼠泼尼松抵抗。

关键词：激素抵抗性肾病综合征；淫羊藿苷；足细胞；阿霉素肾病；Wnt/β-catenin/TRPC6/CaN通路；大鼠

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2024)05-0085-07 DOI：10.19879/j.cnki.1005-5304.202310018 开放科学（资源服务）标识码（OSID）： Discussion on the Mechanism of Icariin in Improving Prednisone Resistance in Rats with

Steroid-Resistant Nephrotic Syndrome Based on Wnt/β-catenin/TRPC6/CaN Pathway

BAI Junyuan1, DAI Enlai2, PU Xiaowei2, ZHANG Yunxia2

1. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730020, China;

2. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730020, China

Abstract: Objective To observe the improving effects of icariin on the improvement of prednisone resistance in steroid resistant nephrotic syndrome (SRNS) rats and its effects on the Wnt/β -catenin/TRPC6/CaN pathway. Methods Totally 50 SD rats were divided into blank group, model group, prednisone group (6.3 mg/kg), icariin group (50 mg/kg) and combination group, with 10 rats in each group. Twice tail vein injections of adriamycin were used to establish a SRNS rat model, and corresponding interventions were given for 6 weeks. General condition of rats was observed, 24-hour urinary protein quantification (24 h-UTP), urine 17-hydroxycorticosteroids (17-OHCS), and serum基金项目：国家自然科学基金（82160852）通讯作者：戴恩来，E-mail：del@gszy.edu.cn

biochemical indicators were detected, renal tissue pathological morphology and ultrastructure were observed by Masson staining, RT-PCR and Western blot were used to detect Wnt/β-catenin/TRPC6/CaN pathway related genes and protein expressions in renal tissue. Results Compared with the blank group, the body mass, feed intake and water intake of rats in the model group significantly decreased, 24 h-UTP increased, urine 17-OHCS content decreased (P< 0.01), the contents of serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), total cholesterol (TC) and triglycerides (TG) inserum increased (P<0.01), while the contents of total protein (TP) and albumin (ALB) decreased (P<0.05, P<0.01); glomerular enlargement, thickening of basement membrane, thickening of balloon wall with fibrosis, vacuolar degeneration of podocytes, and deposition of a large amount of collagen fibers appeared, collagen volume fraction (CVF) increased (P<0.01); Wnt, β -catenin, TRPC6, CaM, CaN and NFAT1 mRNA and protein expressions significantly increased (P<0.01), while the mRNA and protein expressions of F-actin and MYH9 were significantly reduced (P<0.01). Compared with the model group, rats in the combination group showed a significant increase in body mass and water intake, a decrease in 24 h-UTP, and an increase in urine 17-OHCS content (P<0.01); the contents of SCr, BUN and TG decreased (P<0.01); the degree of renal tissue fibrosis was reduced, CVF was reduced (P<0.01), foot process fusion phenomenon was significantly improved, and podocyte structure tends to be normal; Wnt, β-catenin, TRPC6, CaM, CaN and NFAT1 mRNA and protein expressions were significantly decreased, while the mRNA and protein expressions of F-actin and MYH9 significantly increased (P<0.01, P<0.05). Conclusion Icariin may inhibit Wnt/β -catenin/TRPC6/CaN pathway to upregulate the expression of skeleton proteins F-actin, MYH9, thereby protecting podocyte structure, slowing podocyte damage, and improving prednisone resistance in SRNS rats.

Keywords: steroid resistant nephrotic syndrome; icariin; podocyte; adriamycin nephropathy; Wnt/β -catenin/ TRPC6/CaN pathway; rats足量糖皮质激素治疗4～6周仍未缓解的原发性肾

病综合征儿童、青少年[1-2]及使用常规剂量（泼尼松

1 mg/kg·d）激素治疗16周后无效且伴多药耐药的成人患者[3]即可诊断为激素抵抗性肾病综合征（steroid resistant nephrotic syndrome，SRNS）。对激素的反应是判定肾功能预后的重要指标[4]，SRNS导致进展为终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）的风险增加，是20岁前ESRD的第二大常见原因[5]。

SRNS组织病理上以局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis，FSGS）较常见且预后较差[6]。足细胞损伤和丢失是进展性肾小球硬化发

[7]

展的关键事件 ，瞬时受体电位阳离子通道6 （TRPC6）介导Ca2+-CaM-CaN通路活化是导致足细胞骨架蛋白结构及其动力学异常的主要病理机制，在足细胞损伤、凋亡直至肾小球硬化中发挥重要作用。因此，维持足细胞骨架蛋白结构及功能正常是SRNS潜在治疗方案。淫羊藿苷为淫羊藿主要活性成分，前期研究表明，其对内分泌系统有显著作用，能改善肾功能、

保护足细胞[8]，同时能调节激素及受体水平[9]，通过多

途径、多靶点治疗SRNS，但其机制有待进一步探索。本研究在此基础上，进一步观察淫羊藿苷对足细胞骨架蛋白的影响，探讨其改善足细胞损伤的可能机制。1实验材料

1.1动物

SPF级健康雄性SD大鼠50只，体质量（180± 20）g，甘肃中医药大学科研实验中心提供，动物生产许可证号 SCXK （甘） 2020-001 ，动物合格证号620010000000641。大鼠饲养于甘肃中医药大学科研实验中心，温度25 ℃，湿度30%～50%，自由进食饮水，标准饲料喂养。本实验经甘肃中医药大学动物实验伦

理委员会审批（2021-088），各项操作符合实验动物福

利伦理原则。

1.2 药物及制备

阿霉素（ADR），北京索莱宝科技，货号D8740，临用前以生理盐水配制成2 mg/mL用于尾静脉注射。醋酸泼尼松片，浙江仙琚制药，批号180977，5 mg/片，临用前以生理盐水配制成0.63 mg/mL溶液。淫羊藿苷，北京索莱宝科技，批号1128F021，临用前以生理盐水配制成0.5 mg/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

Wnt1抗体（美国Affinity公司，货号AF5315）， β-连环蛋白（β-catenin）抗体（英国

Abcam公司，货号ab32572），TRPC6抗体（美国GeneTex公司，货号GTX113858），钙调神经磷酸酶（CaN）抗体（英国Abcam公司，货号ab109412），活化 T细胞核因子

（NFAT）1抗体（美国Affinity公司，货号DF7189），钙调蛋白（ CaM ）抗体（英国Abcam公司，货号ab45689），F-肌动蛋白（F-actin）抗体（英国Abcam公司，货号 ab130935 ），非肌性肌球蛋白重链9 （MYH9）抗体（美国Affinity公司，货号AF7797）， BCA蛋白定量试剂盒（北京索莱宝公司，货号PC0020）。NanoDrop核酸浓度测量仪（美国Thermo公司，型号 ND-ONE-W ），实时定量PCR仪（美国Thermo公司，型号StepOne Plus），Western blot电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号DYCZ-25D），酶标仪（美国Bio-Rad公司，型号iMark），化学发光成像仪（北京赛智科技有限公司，型号MiniChemi 610），全自动生化分析仪（瑞士罗氏公司，型号Aobasc701），透射电子显微镜（日本Hitachi公司，型号HT7700）。

2 实验方法

2.1 造模、分组及给药

50只大鼠采用随机数字表法分为空白组（10只）及造模组（40只）。造模组实验第1日尾静脉注射ADR 4 mg/kg、第8日注射ADR 3.5 mg/kg，空白组注射等体积生理盐水。第2次注射ADR后开始检测尿蛋白，每周1次，共检测9周，24 h尿蛋白定量（24 h-UTP）>

[10]

50 mg提示SRNS模型建立成功 。本实验中第2次尾静脉注射ADR后14 d模型建立成功，将40只成模大鼠随机分为模型组、泼尼松组、淫羊藿苷组和联合组，每组10只。基于课题组前期实验所得最佳剂量，泼尼松组予泼尼松溶液6.3 mg/kg灌胃，淫羊藿苷组予淫羊藿苷溶液50 mg/kg灌胃，联合组予泼尼松溶液+淫羊藿苷溶液灌胃，空白组和模型组予生理盐水10 mL/kg灌胃，每日1次，连续6周。实验期间每周测量大鼠体质量、进食量、饮水量。

2.2 标本采集

每周采集大鼠24 h尿液，记录尿量，离心后收集尿液上清液，检测24 h-UTP，末次尿采用ELISA检测17-羟皮质类固醇（17-OHCS）含量。干预结束后，2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，心脏采血，3 000 r/min离心10 min，取血清保存待测。右肾经生理盐水冲洗后钝性剥离肾包膜，用于病理检测，左肾用于分子生物学检测。

2.3 血清生化指标和肾功能指标检测

全自动生化仪检测血肌酐（ SCr ）、血尿素氮（BUN）及血清总蛋白（TP）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、白蛋白（ALB）含量。

2.4 肾组织病理学检测

右肾组织充分固定24 h，脱水、透明、浸蜡、包埋，用于Masson染色，倒置光学显微镜观察肾组织结构变化。应用Image J图像分析软件分析胶原纤维面积，计算胶原容积分数（CVF）。CVF（%）=胶原纤维面积÷视野总面积×100%。

2.5 肾组织超微结构观察

分别于肾脏上极、下极进行多点取材，置入电镜固定液中，经脱水、包埋、染色后，透射电镜观察肾组织超微结构改变。

2.6 RT-PCR检测

左肾组织加入TRK Lysis Buffer提取总RNA，部分RNA用于纯度及浓度检测，对RNA行去DNA处理，同时制备cDNA反应体系，cDNA产物用于配制PCR反应体系。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。

-ΔΔCt

2 法计算mRNA相对表达量。Primer-BLAST在线设计目的基因及内参基因引物，北京擎科生物科技股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

基因名称 引物序列（5'～3'） 产物长度/bp GAPDH F：GGGTCCCAGCTTAGGTTCAT 75 R：TACGGCCAAATCCGTTCACA Wnt F：CTCCGAAGTAGCCGGGAATC 217 R：CATCTACAAATGCACGGGCG β-catenin F：CACCATCGAGAGGGCTTGTT 155 R：CGCACTGCCATTTTAGCTCC TRPC6 F：GTGAACGAAGGGGAGCTGAA 156 R：GCGGCTTTCCTCTTGTTTCG CaM F：CCATGTTGCATGTGGCTTCC 124 R：GCCGACGGTTCCTAAAGCTA CaN F：GCTTGAATTCTCACGGCGTC 106 R：GCTTAGCTTGCTTCCATGCC NFAT1 F：ATGCCCCCTTATGGAACACG 164 R：TTCTGTGCGTTGGGAAAGGT F-actin F：GAGAAGTCCTACGAGCTGCC 104 R：GCCTCCATTCCCAAGAACGA MYH9 F：ATCTCGTGCTATCCGCCAAG 89 R：CAGTCTTCAGGTGCTCTCCG 2.7

Western blot检测

取左肾组织100 mg，加入裂解液充分裂解、匀浆，离心后收集上清液，BCA法蛋白定量后进行电泳、转

Wnt、β-catenin、膜、封闭，室温摇床孵育1.5 h，置于TRPC6、CaM、CaN、NFAT1、MYH9、F-actin 一抗稀释液（均为1∶1 000 ）中， 4 ℃慢摇孵育过夜， TBST洗膜，加山羊抗IgG（1∶6 000），室温孵育1 h， TBST洗膜，ECL显色，化学发光成像系统进行曝光显影观察，采用Image J软件对条带进行定量分析。

3统计学方法

统计软件进行分析。计量资料以xˉ±s采用SPSS24.0表示，组间比较采用方差分析，LSD-t检验进行两两比较，不符合正态分布采用Kruskal-Wallis H检验。P< 0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 淫羊藿苷对模型大鼠体质量、进食量及饮水量的影响

干预结束后，泼尼松组大鼠死亡3只、联合组死亡2只。给药前，模型组、泼尼松组、淫羊藿苷组、联合组大鼠体质量、进食量、饮水量较空白组明显减少

（P<0.01，P<0.05）。给药后，模型组大鼠体质量、进

4.4 淫羊藿苷对模型大鼠肾组织形态的影响

Msson染色结果显示，与空白组比较，模型组大鼠肾小球增大，节段性硬化，基底膜明显增厚，球囊壁增厚伴纤维化，球囊粘连，肾小球、肾小管间质及上皮有大片蓝色胶原纤维沉积，CVF明显增加（P< 0.01）；泼尼松组和淫羊藿苷组病理损伤均较模型组改善，联合组纤维化程度较模型组明显减轻，病理情况有所改善，泼尼松组和联合组CVF明显减少（P<

食量、饮水量较空白组明显减少（P<0.01）；泼尼松

组、淫羊藿苷组、联合组大鼠体质量、进食量、饮水量均高于模型组，其中联合组体质量、饮水量差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

4.2 淫羊藿苷对模型大鼠24 h尿蛋白定量和尿17-羟皮质类固醇含量的影响

给药后与空白组比较，模型组24 h-UTP明显升高（P<0.01），尿17-OHCS含量明显下降（P<0.05）；与模型组比较，泼尼松组和联合组24 h-UTP明显降低（P< 0.01），淫羊藿苷组和联合组尿17-OHCS含量明显升高

（P<0.01），且联合组作用优于泼尼松组（P<0.01）。

见表3。注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；与泼尼松组比较，△△P<0.01