CJI (Traditional Chinese Medicine)
越婢汤对阿霉素诱导的人脐静脉内皮细胞高通透性的影响及机制研究
程苏，李婷婷，王艳茹，邵命海上海中医药大学附属曙光医院，上海中医药大学中医肾病研究所，上海中医药大学肝肾疾病病症教育部重点实验室，上海市中医临床重点实验室，上海 201203摘要：目的 研究越婢汤对阿霉素诱导的人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）高通透性的影响，探讨其治疗肾病综合征水肿的可能作用机制。方法 将HUVEC分为对照组、模型组和越婢汤低、中、高剂量组（200、300、400 μg/mL），CCK-8法检测细胞活力，Transwell法检测细胞通透性，Western blot检测凋亡信号调节激酶1（ASK1）、闭锁小带蛋白-1（ZO-1）、血管内皮-钙黏蛋白（VE-cadherin）、p38蛋白表达，免疫荧光法检测ZO-1和VE-cadherin表达。结果 与对照组比较，模型组HUVEC细胞活力明显降低，细胞通透性明显增加，细胞肿胀、膜结构破坏，ASK1、p-p38蛋白表达明显升高，ZO-1、VE-cadherin蛋白表达明显降低（P<0.01）；与模型组比较，越婢汤各剂量组细胞活力明显增加，细胞通透性明显降低，ASK1、p-p38蛋白表达明显降低，ZO-1、VE-cadherin蛋白表达明显升高（P<0.05，P<0.01）。结论 越婢汤可改善阿霉素诱导的HUVEC高通透性，其作用机制可能与抑制ASK1/p38信号通路、上调细胞连接蛋白表达相关。关键词：越婢汤；人脐静脉血管内皮细胞；肾病综合征；凋亡信号调节激酶1；p38中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2024)05-0092-07 DOI：10.19879/j.cnki.1005-5304.202309338开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Study on the Effects and Mechanism of Yuebi Decoction on Adriamycin-induced Hyperpermeability of Human Umbilical Vein Endothelial Cells
CHENG Su, LI Tingting, WANG Yanru, SHAO Minghai
Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; TCM Institute of Kidney Disease, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Liver and Kidney Diseases, Ministry of Education, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; Shanghai Key Laboratory of
Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, China
Abstract: Objective To investigate the effects of Yuebi Decoction on adriamycin-induced hyperpermeability of human umbilical vein vascular endothelial cells (HUVEC); To explore the possible mechanism of its therapeutic effect on edema in nephrotic syndrome. Methods HUVEC were divided into control group, model group and Yuebi Decoction low-, medium-, and high-dosage groups (200, 300, 400 μg/mL). CCK-8 method was used to detect cell viability, Transwell method was used to detect cell permeability, Western blot was used to detect the expression of apoptosis signal regulated kinase 1 (ASK1), zonula occludens-1 (ZO-1), vascular endothelial-cadherin (VE-cadherin), and p38 protein, immunofluorescence method was used to detect the expression of ZO-1 and VE-cadherin. Results Compared with the control group, the cell activity of HUVEC in the model group was significantly decreased, cell permeability significantly increased, and cell swelling and membrane structure damage occurred, the expressions of ASK1 and p-p38 protein significantly increased, while the expressions of ZO-1 and VE-cadherin protein were significantly decreased (P<0.01). Compared with the model group, the cell activity and permeability of基金项目：国家自然科学基金面上项目（81973807）通讯作者：邵命海，E-mail：meck.wx@163.com
Yuebi Decoction low-, medium-, and high-dosage groups significantly increased, and the expressions of ASK1 and p-p38 protein were significantly decreased, and the expressions of ZO-1 and VE-cadherin protein significantly increased (P<0.05, P<0.01). Conclusion Yuebi Decoction can improve the high permeability of HUVEC induced by adriamycin, and its mechanism may be related to the inhibition of ASK1/p38 signaling pathway and upregulation of cell junction protein expression.
Keywords: Yuebi Decoction; HUVEC; nephrotic syndrome; ASK1; p38
水肿是肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）常见症状，影响疾病进展和预后。水肿原因包括血管壁通透性增加、胶体渗透压降低、毛细血管内血压和血
管静水压差升高及淋巴回流受阻等[1-2]。血管通透性是
维持血管、组织和器官之间物质交换的一种选择机制，细胞间连接的破坏和内皮细胞间隙形成是血管通透性
增加的主要特征[3]。血管内皮细胞的功能状态对血管通
透性起决定性作用，而内皮细胞连接的完整性由形成紧密连接和黏附连接的蛋白质调节，包括闭锁小带蛋白-1 （ZO-1 ）、血管内皮-钙黏蛋白（ VE-cadherin）
等[4-6]，调节内皮细胞紧密连接蛋白表达会影响内皮屏
障功能，导致血管通透性变化。
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族通过细胞凋亡途径在屏障功能障碍中发挥重要作用，其家族成员包括p38、细胞外信号调节激酶1/2、c-Jun氨基末端激酶和细胞外信号调节激酶5[7]。相关研究表明，MAPK上游凋亡信号调节激酶1（ASK1）可激活p38 MAPK信号途径、诱导细胞因子产生、加重细胞凋亡和炎症级联反应、破坏细胞骨架结构，影响内皮屏障功能[8-10]。
越婢汤出自《金匮要略·水气病脉证并治》，是治
疗水肿的经典方，结合文献[11-13]及本课题组前期动物实验[14]表明，该方可改善毛细血管通透性，减轻阿霉素（ADR）肾病大鼠水肿。然而，越婢汤在体外实
验中能否影响血管内皮细胞通透性尚不清楚。本实验从细胞水平探讨越婢汤对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）通透性和ASK1/p38通路及下游紧密连接蛋白表达的影响，揭示其调节血管通透性、治疗水肿的可能作用机制。
1 实验材料
1.1 细胞
HUVEC，大连美仑生物技术有限公司，货号PWE-HU087。
1.2 药物及制备
越婢汤（麻黄18 g，石膏24 g，生姜9 g，甘草6g，大枣15 g）冻干粉，泰州医药城国科化物生物医药科技有限公司制备。石膏先煎15 min后，加入其他
药物饮片继续煎煮，提取液置于旋转蒸发仪中，65 ℃、真空度50 mbar、80 r/min浓缩，浓缩液置于减压干燥箱，70 ℃、-0.09 MPa减压干燥，得越婢汤冻干粉。将
μm冻干粉溶解于DMEM培养基中，0.22 微孔滤膜除菌，再配制成相应浓度药液。
1.3 主要试剂与仪器
CCK-8试剂盒（日本同仁化学，货号CK04）， FITC-dextran（德国默克集团，货号FD40），快速封闭液、HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗鼠IgG （上海碧云天生物，货号分别为P0252、A0208、
抗体、α-tubulin A0216），CD31抗体、GAPDH 抗体（美国 Proteintech 公司，货号分别为 11265-1-AP、60004-1-Ig、66031-1-Ig），ZO-1抗体、ASK1抗体（武汉 ABclonal 公司，货号分别为A0659、A12458）， VE-cadherin 抗体、p-p38抗体、p38抗体（美国Cell Signaling Technology公司，货号分别为2500、4511、8690），DMEM细胞培养基、胎牛血清、双抗、ADR （大连美仑生物技术有限公司，货号分别为MA0212-2、PWL001-3、 MA0110、 MB1087 ）。离心机（美国Beckman公司，型号Avanti J-E），凝胶成像系统（上海天能科技有限公司，型号Tanon-5200），恒温培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂，型号HPX-9272 ME），酶标仪（美国BioTek，型号CY TATION3）。
2 实验方法
2.1 人脐静脉血管内皮细胞鉴定
取对数生长期HUVEC接种于6孔板，每孔2×105个细胞，培养至细胞融合度70%～80%时，吸弃培养基，用1 mL预冷PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，每孔加入1 mL免疫细胞通透液，室温通透15 min， PBS清洗3次，1%BSA封闭1h，加兔抗大鼠CD31抗体（1∶200），4℃冰箱孵育过夜，PBS清洗3次，加入二抗（1∶500），室温孵育1h，吸弃二抗，DAPI染色5 min，PBS清洗3次，置荧光显微镜下观察并拍照。2.2 造模条件筛选
2.2.1 细胞活力检测
取对数生长期HUVEC，0.25%胰酶消化，收集细胞，加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬
细胞，调整细胞密度后，将细胞接种于96孔板，每孔1×104个，置于培养箱中培养，细胞贴壁后，PBS洗涤1次，ADR组分别加入含1.25、2.5、5、10、20、μmol/L
40 ADR的培养基，每组6个复孔，对照组加入不含ADR的培养基，空白孔仅加入培养基、不接种细胞，置于培养箱中培养，分别于培养12、24 h后，避光加入CCK-8试剂孵育2h，酶标仪波长450 nm处测定光密度（OD值），计算细胞活力。细胞活力（%）=值-空白 值-空白（样品OD OD值） ÷ （对照OD OD值）×100%。
2.2.2 细胞通透性检测μL
将 200 细胞悬液（含 1×105个细胞）加入μL
Tanswell小室上室，下室加入600 培养基，待细胞贴壁后，吸弃上室和下室培养基，对照组上室和下室μL
分别加入200、600 含0.5%胎牛血清的DMEM培养基，ADR组加入同体积含不同浓度ADR（1.25、2.5、μmol/L）的培养基培养
5、10 12 h，吸弃上室培养基， μL，室温避光加入1 mg/mL FITC-dextran工作液150
培养1 h，吸取下室培养液检测荧光强度，计算渗透率[3]。
2.2.3 细胞超微结构观察
取对数生长期细胞，胰酶消化后收集细胞计数
接种于6孔板，每孔1×106个，24 h后弃去培养基，对照组加入2 mL含0.5%胎牛血清DMEM培养基，其余
μmol/L组分别加入含1.25、2.5、5、10 ADR的培养基，37 ℃、5%CO2恒温培养12 h，吸弃培养基，PBS洗涤，胰酶消化细胞，离心，弃上清液，加入2.5%戊二醛溶液吹散细胞，使细胞悬浮于固定液中，丙酮脱水，树脂包埋固化，切片处理，使用透射电镜进行观察。
2.3 CCK-8法检测越婢汤对细胞活力的影响
HUVEC接种于96孔板，每孔1×104个细胞，分别设置对照组、越婢汤组（100、200、300、400、
μg/mL），常规培养
500 24 h后吸去原培养基，加入含
μL，培养不同浓度越婢汤药液的培养基100 12 h， CCK-8法检测细胞活力。
2.4 Transwell法检测越婢汤对细胞通透性的影响
将HUVEC接种于Transwell小室，每孔1×105个细胞，设置对照组、模型组和越婢汤低、中、高剂量
μg/mL），置于培养箱培养组（200、300、400 12 h，
μmol/L吸弃培养基，模型组加入含1.25 ADR的培养基，越婢汤低、中、高剂量组加入含相应浓度越婢汤及ADR的培养基培养12 h，加入FITC-dextran工作液，按“2.2.2”项下方法检测细胞通透性。
2.5 Western blot检测
将HUVEC接种于6孔板，每孔2×105个细胞，设置对照组、模型组和越婢汤低、中、高剂量组（200、
μ
300、400 g/mL），按“2.4”项下方法培养及加药处理。干预结束后，加入裂解液裂解细胞，经BCA法蛋白定量后制备蛋白样品，凝胶电泳（120 V、60 min），将蛋白转至PVDF膜（100 V、2h），快速封闭液封闭15 min， TBST 洗膜3次，加入ASK1、VE-cadherin、ZO-1、
000）、α-tubulin p38、p-p38一抗（均为1∶1 一抗（1∶ 2 000），4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次，每次8 min，加入HRP标记山羊抗兔二抗或HRP标记山羊抗小鼠二抗（1∶1 000），室温摇床孵育1 h，TBST洗
α-tubulin膜3次，ECL显影，凝胶成像系统成像，以为内参，Image J软件计算蛋白相对表达量。
2.6 免疫荧光染色
制作细胞爬片，按“2.4”项下方法处理后，PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS清洗3次，每孔加入1 mL免疫细胞通透液室温通透15 min， PBS清洗3次，每孔加入1%BSA室温封闭细胞60 min，加入一抗（1∶200），湿盒中4℃孵育过夜，用PBS清洗3次，避光加二抗（1∶ 500），室温孵育60 min， PBS清洗3次，滴加适量DAPI染色液染核5 min，PBS清洗3次，荧光显微镜下采集图像。
3 统计学方法
采用SPSS23.0统计软件进行分析。计量资料符
xˉ±s合正态分布和方差齐性以 表示，两两比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 细胞鉴定结果
采用免疫荧光染色检测HUVEC特异性蛋白CD31可鉴定培养的HUVEC。如图1所示，荧光显微镜下CD31蛋白呈阳性表达，胞体明显着色，呈绿色荧光。图1 HUVEC细胞免疫荧光鉴定（×200） 4.2 造模条件筛选结果与对照组比较，随着ADR浓度和作用时间增加， μmol/L细胞活力逐渐下降；ADR浓度>10 时，作用12 h以上细胞活力低于60%，考虑细胞活力应在60%～ 80%，因此，后续实验选取ADR浓度为1.25、2.5、5、μmol/L，作用
10 12 h进行后续实验。见表1。
表1 xˉ
不同浓度ADR作用不同时间的HUVEC细胞活力比较（ ±s，%，n=6）组别 浓度/（μmol/L） 12 h 24 h
对照组 102.31± 7.57 102.00± 7.97 ADR组 1.25 84.27±11.94## 69.74± 5.71## 2.5 65.46±10.13## 61.90±13.46## 5 63.80± 8.53## 53.77±12.07## 10 47.61± 7.43## 37.47± 6.56## 20 36.86± 6.21## 26.15± 3.68## 40 30.91± 1.37## 17.71± 1.61##注：与对照组比较，##P<0.01
应用 FITC-dextran 对HUVEC通透性进行检测。结果显示， ADR作用12 h增加了HUVEC对 FITCdextran的渗透率（ P<0.05， P<0.01 ），且渗透率随ADR浓度增加而增加。见表2。
渗透率比较（xˉ±s，n=3）
表2不同浓度ADR作用的HUVEC
组别 浓度/（μmol/L）渗透率/%对照组 100.00± 5.70 ADR组 1.25 125.91± 4.66# 2.5 131.09± 5.18## 5 135.75±11.40## 10 161.66±18.65##注：与对照组比较，#P<0.05，##P<0.01为进一步明确不同浓度ADR对HUVEC细胞的损伤，通过透射电镜观察HUVEC超微结构。如图2所示，不同浓度ADR刺激后，HUVEC出现染色质块聚集、线粒体和内质网肿胀，细胞膜破坏、裂解。考虑细胞活力与细胞毒性的平衡，并结合上述实验结果， μmol/L
最终选择1.25 ADR处理12 h为造模条件。μg/mL越HUVEC生长无明显抑制作用，且200～400婢汤组细胞活力更稳定，故选择越婢汤200、300、μ
400 g/mL为低、中、高剂量组。见表3。细胞活力的影响（xˉ±s，n=6）
表3不同浓度越婢汤对HUVEC
组别浓度/（μg/mL）细胞活力/%对照组102.90±15.47
越婢汤组100 86.58± 6.63 200 102.63±13.51 300 103.59±13.48 400 102.32±16.43 500 74.46± 5.24##注：与对照组比较，##P<0.01
4.4越婢汤对模型细胞通透性的影响与对照组比较，模型组细胞渗透率明显升高（P< 0.01）；与模型组比较，越婢汤低、中、高剂量组细胞渗透率明显降低（P<0.01）。见表4。渗透率比较（xˉ±s，n=3）
表4 各组HUVEC
组别浓度/（μg/mL）渗透率/%对照组100.00± 2.28模型组175.34±10.96##越婢汤低剂量组200 121.16± 6.09**越婢汤中剂量组300 118.72± 7.31**越婢汤高剂量组400 119.33± 6.70**
注：与对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01
4.5 越婢汤对模型细胞凋亡信号调节激酶1、血管内皮-钙黏蛋白、闭锁小带蛋白-1、p38蛋白表达的影响
与对照组比较，模型组ASK1和p-p38蛋白表达明显升高，ZO-1、VE-cadherin蛋白表达明显降低（P< 0.01）；与模型组比较，越婢汤低、中、高剂量组ASK1和p-p38蛋白表达明显降低（P<0.05），ZO-1和VE-cadherin 蛋白表达明显升高（P<0.05，P<0.01）。见图3、表5。注：A.对照组；B.模型组；C.越婢汤低剂量组；
D.越婢汤中剂量组；E.越婢汤高剂量组
各组HUVEC ASK1、VE-cadherin、ZO-1、p38蛋白免疫印迹
4.6 越婢汤对模型细胞血管内皮-钙黏蛋白、闭锁小带蛋白-1表达的影响
使用免疫荧光法进一步验证越婢汤对HUVEC紧密连接蛋白表达的影响。结果显示，与对照组比较，模型组HUVEC ZO-1、VE-cadherin呈低水平表达；与模型组比较，越婢汤低、中、高剂量组均可增强HUVEC ZO-1和VE-cadherin表达，与Western blot结果一致。见图4、图5、表6。
组织或组织间隙，引起水肿[16]。
ADR是一种有效的抗肿瘤药物，临床上可用于治疗多种类型癌症，其毒性也使其在基础研究中广泛运用。研究表明，ADR可导致心、肾等多脏器内皮损伤，破坏内皮细胞屏障，增加血管通透性，造成组织水肿[17-19]；内皮细胞对ADR表现出高敏感性，ADR有长期不可逆作用，通过增强氧化和亚硝化应激增加化疗药物的渗透性，降低血管内皮细胞活力，同时破坏内皮细胞屏障功能[20-21]。因此，应用ADR可模拟不良刺激对HUVEC产生的作用，从而诱导HUVEC高通透性模型。
《金匮要略·水气病脉证并治》载“风水恶风，一身悉肿，脉浮而渴，续自汗出，无大热，越婢汤主之”，越婢汤有疏风解表、宣肺利水功效。方中麻黄辛散温通、宣散肺气、利水消肿；石膏解肌清热，配合麻黄宣肺以发越水气，开毛窍腠理以散水肿；佐以甘
草、生姜、大枣健脾化湿，取其崇土制水之意[22]。临
床观察表明，越婢汤能有效缓解NS患儿水肿症状，减少尿蛋白[23]；同时在ADR肾病大鼠模型中也显示，越婢汤可通过水通道蛋白、ERK等信号通路降低毛细血管通透性，缓解NS水肿[13-14]。
血管内皮是由不同类型黏附结构和细胞间连接形成的连续单层细胞结构，在血管与组织间形成屏障，调节物质和液体进出组织，参与多种疾病的病理过程
和发病机制[24]。内皮通透性的重要结构基础是细胞间
连接，其中黏附连接和紧密连接参与细胞旁转运和细胞间黏附屏障的形成。ZO-1和VE-cadherin是紧密连接和黏附连接的主要成员，常作为评价内皮细胞通透
性改变的重要依据[9，25]，其表达受多条信号通路调控。
Zhao等[26]研究发现，在脓毒血症急性肺损伤中，RAGE通过RhoA/ROCK1信号通路下调ZO-1和VE-cadherin表达，破坏血管屏障功能； Fawad 等[8]提出，抑制MAPK信号通路p38表达可减轻内皮细胞损伤，逆转ZO-1和VE-cadherin下调，维持内皮屏障完整性。
相关研究表明，ASK1/p38信号通路激活与内皮细胞通透性相关[8-9]。ASK1是MAPK家族广泛表达的成员之一，在活性氧、内质网应激等刺激下，通过级联反应激活下游p38 MAPK信号途径，参与凋亡、炎症等多种细胞反应[27-28]。研究表明，激活ASK1/p38信号通路可抑制内皮细胞连接蛋白ZO-1、VE-cadherin和骨架蛋白表达，从而破坏内皮细胞屏障功能，增加血管
[8-10]
壁通透性 。本研究显示， ADR可诱导HUVEC ASK1和p-p38表达上调，下调内皮细胞连接蛋白ZO-1和VE-cadherin表达；越婢汤干预后，HUVEC ASK1
和p-p38蛋白表达降低，同时ZO-1和VE-cadherin表达升高，表明越婢汤可抑制ADR诱导的HUVEC ASK1/ p38信号通路激活，保护紧密连接和黏附连接，维持内皮屏障功能，改善血管内皮细胞通透性。
综上所述，越婢汤可降低HUVEC通透性，其机制可能与抑制ASK1/p38信号通路激活，增强内皮细胞连接蛋白ZO-1、VE-cadherin表达有关。本研究进一步揭示了越婢汤治疗NS水肿的可能机制，今后将使用不同细胞系进一步探讨越婢汤治疗NS水肿作用机制，为临床诊疗提供实验依据。
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（收稿日期：2023-09-15） （修回日期：2023-10-18；编辑：郑宏）