基于Nrf2/HO-1信号通路探讨穴位埋线抑制脾肾阳虚夹瘀型溃疡性结肠炎大鼠氧化应激损伤作用机制

谢超群1，孙豪娴1，张伟1，邹孟龙1，朱莹1，汤美艳 2

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005摘要：目的 观察穴位埋线对脾肾阳虚夹瘀型溃疡性结肠炎（UC）模型大鼠Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达的影响，探讨穴位埋线治疗UC的可能机制。方法 SPF级SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、柳氮磺吡啶（SASP）组和穴位埋线组，每组10只。除空白组外，其余各组通过腺嘌呤、番泻叶分阶段灌胃联合冰水浴+2,4,6-三硝基苯磺酸与乙醇混合试剂灌肠建立脾肾阳虚夹瘀型UC大鼠模型。穴位埋线组选取双侧“足三里”“天枢”“肾俞”“脾俞”“大肠俞”“膈俞”穴位埋线治疗，7 d/次，共2次，SASP组予柳氮磺吡啶混悬液灌胃，空白组和模型组予生理盐水灌胃，1次/d，连续14 d。称量大鼠体质量、观察大便性状和便血情况；测量大鼠结肠长度，观察结肠黏膜损伤情况，对结肠黏膜损伤指数（CMDI）进行评分；HE染色观察结肠组织病理形态变化；生化法测定大鼠血清丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性；RT-PCR和Western blot分别检测结肠组织Kelch样ECH关联蛋白1（Keap1）、核因子E2相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶-1（HO-1）mRNA和蛋白表达。结果 与空白组比较，模型组大鼠体质量下降（P<0.01），结肠长度缩短（P<0.01），结肠黏膜形成明显溃疡面，隐窝结构丧失，腺体排列紊乱，大量炎性细胞浸润，CMDI评分升高（P<0.01），血清MDA含量增加，SOD、CAT、GSH-Px活性降低（P<0.01），结肠组织Keap1 mRNA和蛋白表达升高，Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达降低（P<0.01）；与模型组比较，SASP组和穴位埋线组大鼠体质量增加（P<0.01），结肠长度增加（P<0.01），结肠黏膜病理损伤明显减轻，CMDI评分降低（P<0.01），血清MDA含量降低，SOD、CAT、GSH-Px活性升高（P<0.01），结肠组织Keap1 mRNA和蛋白表达降低，Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达升高（P<0.01）。SASP组和穴位埋线组各指标差异无统计学意义（P>0.05）。结论 穴位埋线可减轻UC大鼠结肠黏膜病理损伤，其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路、抑制氧化应激反应有关。关键词：穴位埋线；溃疡性结肠炎；Nrf2/HO-1信号通路；氧化应激反应

中图分类号：R245.9 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2024)05-0105-07 DOI：10.19879/j.cnki.1005-5304.202303507 开放科学（资源服务）标识码（OSID）： Discussion on Mechanism of Acupoint Catgut Embedding in Inhibiting Oxidative Stress Injury in Rats with Ulcerative Colitis of Spleen-kidney Yang Deficiency and Blood Stasis Based on Nrf2/HO-1 Signaling Pathway

XIE Chaoqun1, SUN Haoxian1, ZHANG Wei1, ZOU Menglong1, ZHU Ying1, TANG Meiyan2

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China;

2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410005, China Abstract: Objective To observe the effects of acupoint catgut embedding on the expression of Nrf2/HO-1 signaling pathway related proteins in ulcerative colitis (UC) model rats with spleen-kidney yang deficiency and blood stasis; To explore the possible mechanism of acupoint catgut embedding in the treatment of UC. Methods SPF SD基金项目：国家自然科学基金（ 81874466）；湖南省中医药科研计划 （D2022025 ）；湖南省自然科学基金面上项目（2021JJ30531）；湖南中医药大学研究生创新课题（2022CX34）通讯作者：汤美艳，E-mail：1519921997@qq.com

male rats were randomly divided into blank group, model group, SASP group and acupoint catgut embedding group, with 10 rats in each group. Except for the blank group, the other groups were established by adenine, senna phased gavage combined with ice water bath intervention + 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid and ethanol complex enema to establish a UC rat model with spleen-kidney yang deficiency and blood stasis. Acupoint catgut embedding group selected “Zusanli”, “Tianshu”, “Shenshu”, “Pishu”, “Dachangshu” and “Geshu” for acupoint catgut embedding treatment, 7 days/time, twice. The SASP group was given SASP solution by gavage, and the blank group and the model group were given normal saline by gavage daily, once a day, for consecutive 14 d. The body mass, stool characteristics and hematochezia of rats in each group were observed; the colon length of rats was measured; the colonic mucosal injury was observed, and the score of colon mucosa damage index (CMDI) was evaluated; HE staining was used to observe the pathological change in colonic tissue; MDA content and SOD, CAT, and GSH-Px activities in serum were detected by biochemical method; RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of Keap1, Nrf2 and HO-1 mRNA and protein expression in colonic tissue. Results Compared with the blank group, the body mass of the rats in the model group significantly decreased (P<0.01), the colon length was significantly shortened (P<0.01), the colonic mucosa formed obvious ulcer surface, the crypt structure was lost, the gland arrangement was disordered, and a large number of inflammatory cells infiltrated, the CMDI score significantly increased (P<0.01), the content of MDA in serum increased, the activities of SOD, CAT and GSH-Px decreased (P< 0.01), the expressions of Keap1 mRNA and protein in colonic tissue increased, and the expressions of Nrf2 and HO-1 mRNA and protein significantly decreased (P<0.01). Compared with the model group, the body mass of the acupoint catgut embedding group and the SASP group significantly increased (P<0.01), the colon length of the rats significantly increased (P<0.01), the pathological damage of the colon mucosa was significantly reduced, and the CMDI score significantly decreased (P<0.01), the content of MDA in serum decreased, the activities of SOD, CAT and GSH-Px increased (P<0.01), the expressions of Keap1 mRNA and protein in colonic tissue decreased, and the expressions of Nrf2 and HO-1 mRNA and protein increased significantly (P<0.01). There was no significant difference in the indexes of SASP group and acupoint catgut embedding group (P<0.01). Conclusion Acupoint catgut embedding can reduce the pathological damage of colonic mucosa in UC rats, and its mechanism may be related to the activation of Nrf2/HO-1 signaling pathway and the inhibition of oxidative stress response.

Keywords: acupoint catgut embedding; ulcerative colitis; Nrf2/HO-1 signaling pathway; oxidative stress response

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种高复发率的慢性非特异性炎症性疾病，发病隐匿，早期诊断困难、病情复杂、迁延难愈，全球各年龄段UC发病率和患病率呈逐年升高趋势[1-2]。其主要症状有腹痛、腹泻、黏液脓血便，严重影响患者生活质量[3-4]。近年来，UC发病率和患病率在我国有明显升高趋势[5]，对其发病机制的研究和有效防治方案的探寻刻不容缓。研究发现，氧化应激反应过度激活导致的结肠组织氧化应激损伤是UC发病的重要原因，Nrf2/HO-1信号通路是机体抵御氧化应激损伤的重要防御系统[6-7]。临床及动物实验表明，穴位埋线可调节炎症平衡而治疗

UC[8-10]，但其对氧化应激的调控作用研究相对较少，因此，本研究以UC大鼠为研究对象，以Nrf2/HO-1信号通路为切入点，探讨穴位埋线抗氧化应激治疗UC的作用机制，为防治UC提供新的策略和方向。1材料与方法

1.1动物

SPF级雄性SD大鼠40只，体质量180～220 g，湖南中医药大学动物实验中心提供，动物生产许可证号SCXK（湘）2019-0004。饲养于温度24～26 ℃、湿度40%～60%环境，12 h昼夜循环。本实验经湖南中医药大学第一附属医院动物伦理委员会审批（ZYFY20190814-1）。

1.2 主要试剂与仪器

腺嘌呤（美国Sigma，批号A8626），2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS，美国Sigma，批号P2297），柳氮磺吡啶（SASP）肠溶片（上海信谊天平药业有限公司，批号09190501），大便隐血定性检测试剂（北京雷根生物技术有限公司，批号0924A20），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽

过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（南京建成生物科技有限公司，批号分别为A003-1-2、A001-3-2、A007-1-1、A006-2-1），总RNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号R1200），反转录试剂盒（日本Toyobo，批号FSQ-101），GAPDH抗体（美国Proteintech，批号10494-1-AP），Kelch样ECH关联蛋白1（Keap1）、核因子 E2相关因子2 （Nrf2 ）、血红素加氧酶-1 （HO-1）抗体（英国Abcam，批号分别为ab119403、ab156883、 ab189491 ），山羊抗兔二抗（美国Proteintech，批号 SA00001-2）。7号一次性埋线针、4-0可吸收胶原蛋白线（山东博达医疗用品股份有限公司，货号分别为BD220703、20220916），荧光定量PCR仪（美国ABI，型号7300），Western blot电泳仪、快速转膜仪（北京六一，型号分别为DYCZ-24DN、DYCZ-40DN），水平摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，型号TS-1），多功能酶标分析仪（深圳市汇松科技发展有限公司，型号MB-530），电子天平、离心机（湖南湘仪，型号分别为TP-2000E、H1650R），病理切片机（德国徕卡仪器有限公司，型号RM2016）。1.3 造模及分组

大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法抽取10只作为空白组，其余30只作为造模组，参照文献[11]制备脾肾阳虚夹瘀型UC大鼠模型：予腺嘌呤、番泻叶分阶段灌胃+冰水浴，连续4周；第29日禁食不禁水24 h， 10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，在液体石蜡油润滑下，从肛门插入8 cm灌胃针，推注5%TNBS（100 mg/kg）+50%乙醇0.25 mL制成的混合试剂，轻揉腹部使试剂与结肠充分接触，捏紧大鼠肛门并提起大鼠尾部倒置2 min。造模后可见大鼠反应迟钝、大便溏泄和/或伴有黏液脓血便、体质量下降。随机选取空白组和造模组各3只大鼠麻醉处死，造模组大鼠肉眼可见结肠充血、水肿、糜烂、溃疡形成等改变，光镜下显示炎性细胞浸润，隐窝及腺体破坏严重、结构模糊等病理改变；血清游离三碘甲状腺原氨酸、游离甲状腺素、睾丸酮、皮质醇含量降低，血液流变学提示血黏度升高，血清白细胞介素（IL）-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α

含量增加，提示“虚、瘀”状态下UC模型造模成功[9，12-14]。将剩余造模成功的27只大鼠随机分为模型组、SASP组和穴位埋线组，每组9只，空白组剩余7只。

1.4 干预

造模成功后第3日开始干预。穴位埋线组取双侧“足三里”“天枢”“肾俞”“脾俞”“大肠俞”“膈俞”[15]，选用7号一次性埋线针，在对应腧穴备皮，将5 mm 4-0羊肠线埋置于腧穴皮下组织或肌层，“足三里”直刺、“天枢”斜刺、“脾俞”“肾俞”“大肠俞”“膈俞”均在腧穴下方向上平刺，退出针头并检查有无线头外露，每7日埋线1次，共埋线2次。SASP组将柳氮磺吡啶肠溶片用0.9%氯化钠溶液配制成10 mg/mL混悬液后灌胃，给药剂量50 mg/（kg·d），空白组、模型组予等量生理盐水灌胃，灌胃体积5 mL/kg，每日1次，连续14 d。

1.5 指标检测

1.5.1 一般状况观察

每日观察并记录大鼠体质量、饮食饮水情况、大便性状及便血情况。

1.5.2 结肠长度检测和结肠黏膜损伤指数评分

干预结束后麻醉大鼠，腹主动脉采血后，采集大鼠回盲部至肛门整个结肠和直肠段测量长度，并取距肛门6～10 cm结肠段，剪开肠腔，生理盐水冲洗，滤纸吸干，参考结肠黏膜损伤指数（CMDI）评分标准[16]进行评分，见表1。

表1

CMDI评分标准1.5.3 结肠组织病理形态观察

使用4%多聚甲醛固定结肠组织，梯度乙醇脱水，

μm），HE石蜡包埋，切片（厚4 染色，显微镜下观察结肠组织病理变化。

1.5.4 生化法检测氧化应激水平

腹主动脉取血后，4℃冰箱静置1h，3 000 r/min离心15 min，取血清，严格按试剂盒说明书测定血清MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性。

1.5.5 PCR检测

取结肠组织25 mg研碎，用Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA后，加入扩增反应体系，进行PCR检测。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s， 60 ℃退火30 s，共 40个循环。以GAPDH为内参， 2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表2。1.5.6 Western blot检测

取20 mg结肠组织，加入RIPA裂解液匀浆，离心后取上清液，BCA法检测蛋白浓度。配制分离胶和浓缩胶，进行电泳，将蛋白电转至PVDF膜上，室温摇床

封闭2h，加入一抗（Keap1 1∶1 000、Nrf2 1∶2 000、HO-1 1∶1 000、GAPDH 1∶5 000），4 ℃孵育过夜。PBST洗膜，加入二抗（1∶5 000），室温孵育1 h， ECL显色曝光。Image J软件对条带进行灰度分析，以目的蛋白与内参（GAPDH）灰度值比值计算蛋白相对表达量。1.6统计学方法

采用SPSS21.0和GraphPad Prism 9.0软件进行分

xˉ±s

析。计量资料以 表示，多组间比较用方差分析，两两比较采用LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。2 结果

2.1 穴位埋线对模型大鼠一般状况的影响

经TNBS诱导的UC大鼠可见肉眼血便，所有造模大鼠精神倦怠、嗜睡懒动、毛色枯槁无泽、明显消瘦、饮食量减少，并伴有不同程度腹泻、黏液脓血便。与

空白组比较，模型组大鼠体质量减轻（P<0.01），且体

质量增加缓慢；与模型组比较，SASP组和穴位埋线组大鼠体质量增加（P<0.01），SASP组和穴位埋线组大鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01各组大鼠体质量变化（xˉ±s，每组

图1 4只）

2.2 穴位埋线对模型大鼠结肠长度及结肠黏膜损伤指数评分的影响与空白组比较，模型组大鼠结肠长度缩短（P< 0.01）；与模型组比较，SASP组和穴位埋线组大鼠结肠长度增加（P<0.01），SASP组和穴位埋线组结肠长度差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01各组大鼠结肠长度比较（xˉ±s，每组

图2 6只）与空白组比较，模型组大鼠结肠黏膜可见充血水肿、糜烂明显，肠腔内可见多处溃疡灶，腺体排列不规则，CMDI评分显著升高（P<0.01）；与模型组比较， SASP组和穴位埋线组大鼠结肠黏膜轻度充血、水肿，少数肠壁可见糜烂及溃疡灶，CMDI评分显著降低（P<0.01），SASP组和穴位埋线组CMDI评分差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01评分比较（xˉ±s，每组

图3各组大鼠结肠形态及CMDI 6只） 2.3 穴位埋线对模型大鼠结肠组织形态的影响空白组大鼠结肠黏膜完整，排列规则整齐，未见明显充血血肿、炎性细胞浸润、糜烂溃疡；模型组大鼠结肠黏膜不连续，可见明显溃疡面，隐窝破坏明显，腺体排列紊乱，黏膜水肿、充血明显，大量炎性细胞浸润；SASP组和穴位埋线组结肠黏膜逐渐恢复正常，黏膜下层轻度水肿，少量炎性细胞浸润，整体上损伤减轻。见图4。

2.4 穴位埋线对模型大鼠血清氧化应激水平的影响与空白组比较，模型组血清MDA含量显著升高

（P<0.01），SOD、CAT、GSH-Px活性显著降低（P<

0.01）；与模型组比较，SASP组和穴位埋线组血清MDA含量显著降低（P<0.01），SOD、CAT、GSH-Px活性显著升高（P<0.01），SASP组和穴位埋线组血清MDA、SOD、CAT、GSH-Px差异无统计学意义（P> 0.05）。见表3。