基于HPLC指纹图谱及色度值的当归与油当归比较研究

党文飞1，张红伟1，周洁1，周晶晶1，窦霞2，3，靳子明2，3

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000；

3.杨锡仓全国名老中医药专家工作室，甘肃 兰州 730000

摘要：目的 通过建立指纹图谱结合色度值分析当归与油当归的差异。方法 采用HPLC建立当归油炒前后样品指纹图谱，评价相似度并指认共有峰；以当归油炒前后共有峰峰面积、色度值为指标，运用配对样本t检验、聚类热图分析、主成分分析和正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）对当归油炒前后样品进行区分，以变量重要性投影（VIP）>1为标准筛选差异性标志物。结果 当归、油当归指纹图谱分别标定16、18个共有峰，其中色谱峰8、10号为炮制后产生，共指认6个成分，分别为阿魏酸、绿原酸、藁本内酯、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯。聚类热图、主成分分析结果与OPLS-DA结果一致，均可将样品明显聚为当归和油当归2类；通过VIP值筛选出峰5、峰7（绿原酸）、峰17、峰4、峰18（藁本内酯）、峰9（阿魏酸）、峰1、峰13、峰11 （洋川芎内酯I）、峰2、峰3为导致样品差异的主要标志色谱峰。油当归与当归的色度值差ΔE*值为6.10～12.37，表明二者可被肉眼识别，且L*、a*、b*均可作为鉴别当归与油当归的关键指标。结论 建立的当归和油当归HPLC指纹图谱方法稳定可靠，结合色度值差异可用于区分当归与油当归。关键词：当归；油当归；指纹图谱；色度值；多元统计分析

中图分类号：R283.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2024)05-0112-06 DOI：10.19879/j.cnki.1005-5304.202310145开放科学（资源服务）标识码（OSID）： Comparative Study on the Difference between Angelicae Sinensis Radix and

Oil Angelicae Sinensis Radix Based on HPLC Fingerprint and Chromaticity Value DANG Wenfei1, ZHANG Hongwei1, ZHOU Jie1, ZHOU Jingjing1, DOU Xia2,3, JIN Ziming2,3

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China;

2. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China;

3. Yang Xicang National Famous Old Chinese Medicine Experts Workshop, Lanzhou 730000, China Abstract: Objective To analyze the difference between Angelicae Sinensis Radix and oil Angelicae Sinensis Radix by establishing a fingerprint and combining the chromaticity value. Methods HPLC method was used to establish the fingerprint before and after frying Angelicae Sinensis Radix with oil, and the similarity was evaluated and the common peak was identified. Taking the total peak area and chromaticity value before and after frying Angelicae Sinensis Radix with oil as the indicators, paired sample t-test, cluster heat map analysis, principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) were used to distinguish before and after frying Angelicae Sinensis Radix with oil. The differential markers were screened out by variable importance projection (VIP) >1. Results The established fingerprints of Angelicae Sinensis Radix and oil Angelicae Sinensis Radix were calibrated with 16 and 18 common peaks, respectively, among which, chromatographic peaks 8 and 10 were generated after processing. A total of 6 components were identified, including ferulic acid, chlorogenic acid, ligustilide, senkyunolide I, senkyunolide H, and ferulic acid pine ester. The clustering heatmap and principal component analysis results were consistent with the OPLS-DA results, and the samples could be clearly clustered into基金项目：甘肃省中药炮制技术传承基地项目（2022年）；甘肃省自然科学基金（21JR7RA574）；甘肃省中医药科研课题（GZKP-2022-23）；兰州市人才创新创业项目（2021-RC-104）；兰州市城关区科技计划（2021-2-9）通讯作者：靳子明，E-mail：Jinziming110@sina.com

two categories: Angelicae Sinensis Radix and oil Angelicae Sinensis Radix. Through VIP value screening, peaks 5, 7 (chlorogenic acid), 17, 4, 18 (ligustilide), 9 (ferulic acid), 1, 13, 11 (senkyunolide I), 2, and 3 were identified as the main chromatographic peaks that caused sample differences. The difference in chromaticity value ΔE* between Angelicae Sinensis Radix and oil Angelicae Sinensis Radix was 6.10 to 12.37, indicating that they could be recognized by the naked eye, and L*, a* and b* could all be used as key indicators for distinguishing Angelicae Sinensis Radix from oil Angelicae Sinensis Radix. Conclusion The established HPLC fingerprinting method for Angelicae Sinensis Radix and oil Angelicae Sinensis Radix is stable and reliable, and can be used to distinguish Angelicae Sinensis Radix from oil Angelicae Sinensis Radix by combining the difference in chromaticity value.

Keywords: Angelicae Sinensis Radix; oil Angelicae Sinensis Radix; fingerprint; chromaticity value; multivariate statistical analysis

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.） Diels的干燥根，味甘、辛，性温，归肝、心、脾经，具有补血活血、调经止痛、润肠通便功效[1]。药理研究表明，当归具有镇痛、抗炎、抗氧化、清除自由基、增强免疫功能、保肝护肾作用[2-4]。临床常用当归炮制

品有当归、酒当归和当归炭等，另有油当归等炮制品收载于《甘肃省中药炮制规范》，当归油炒可增强其润肠通便作用，主要用于血虚肠燥便秘[5]。本研究建立

HPLC指纹图谱，结合色度分析，运用聚类分析、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）等多元统计分析方法对当归及油当归进行比较和综合评价，为二者的鉴别和质量控制提供依据。

1 仪器与试药

LC-20AD型HPLC仪（配备DGU-20A型在线脱气系统、SIL-20A型自动进样系统、CTO-20A型柱温箱、SPD-M20A型二极管阵列检测器），日本岛津公司；YP20002电子天平，上海衡际科学仪器有限公司； CPA225D型十万分之一分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；KQ-500VDE型双频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SC10型色差计，深圳市三恩驰科技有限公司。

阿魏酸（批号L03A9D57744）、绿原酸（批号wkq21040904）、藁本内酯（批号RO6S10F97106）、洋川芎内酯I（批号P16A10F85918）、洋川芎内酯H（批号P16A10F85917）、阿魏酸松柏酯（批号W26A10Z96 066），上海源叶生物科技有限公司；甲酸（批号20221212），成都金山化学试剂有限公司；甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。

10批当归饮片（S1～S10），购于陇西保和堂药业有限责任公司，批号依次为20221007、20230704、20230502、 20210104、 20230501、 20230804、20230204、20230708、20221106、20220604，产地均为甘肃省定西市陇西县，经甘肃中医药大学附属医院杨锡仓主任中药师鉴定为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根。

2 方法与结果

2.1 油当归制备

依据《甘肃省炮制规范》[5]，取当归饮片（S1～ S10），加入香油拌匀，每100 g饮片用油3g，闷润后置于锅内，用文火加热，炒至色泽加深，微显焦斑，待显油润有香气时出锅，晾凉，即得油当归（J1～J10）。2.2 色谱条件

μ采用Robusta C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 m），流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，2%～15%A；10～25 min，15%～22%A； 25～40 min，22%～55%A，40～50 min，55%～57%A； 50～60 min， 57%A； 60～70 min， 57%～70%A），检测波长280 nm，柱温30 ℃，流速0.8 mL/min，进样

μL。

量10

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液

精密称取阿魏酸、绿原酸、藁本内酯、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为0.142、0.104、0.202、0.144、0.17、0.089 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液

取当归及油当归粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，称重，超声（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，

μm

过0.45 微孔滤膜，即得。

2.4 特征图谱建立

2.4.1 精密度试验

取油当归样品粉末（S1），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，以9号峰阿魏酸为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰的

相对保留时间RSD为0.07%～0.43%，相对峰面积RSD为1.09%～1.86%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验

取油当归样品粉末（S1），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别在制备后0、2、4、8、12、24h按“2.2”项下色谱条件测定，以9号峰阿魏酸为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间RSD为0.05%～0.61% ，相对峰面积RSD 为 0.54%～1.86%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验

取油当归样品粉末（S1），按“2.3.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，以9号峰阿魏酸为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间RSD为0.32%～0.84%，相对峰面积RSD为1.48%～2.33%，表明此方法重复性良好。

2.4.4 相似度评价

取10批当归及油当归样品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，将样品色谱数据（AIA格式）导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）进行分析，分别以当归样品S6、油当归样品J3的图谱为参照图谱，时间窗宽度设定为0.1 min，采用中位数法，多点校正、全谱峰匹配，生成当归和油当归样品的指纹图谱和对照指纹图谱（R），结果见图1。10批当归指纹图谱共标定16个共有峰，10批油当归指纹图谱共标定18个共有峰，通过与混合对照品溶液图谱比对，指认出6个共有峰：7号峰为绿原酸、9号峰为阿魏酸、11号峰为洋川芎内酯I、12号峰为洋川芎内酯H、15号峰为阿魏酸松柏酯、18号峰为藁本内酯。油当归指纹图谱中的色谱峰8、10由当归炮制后产生。以S6为参考图谱，10批当归的相似度为0.986～0.997；以J3为参考图谱，10批油当归的相似度为0.984～0.998，均大于0.9，表明10批当归之间质量差异较小，且炮制后质量比较稳定。

2.5 多元统计分析

2.5.1 峰面积差异性分析

采用SPSS26.0统计软件对10批当归和油当归指纹图谱各共有峰的峰面积进行组间比较。其中，色谱峰8、10在当归样品中未检出，为炮制后产生；色谱峰1、2、4、6、7、9、11、12、13、14、18峰面积数据符合正态分布，采用配对样本t检验；色谱峰3、5、15、16、17峰面积数据不符合正态分布，采用Mann-Whitney U（二样本）检验。

配对样本t检验结果表明，与当归比较，油当归指纹图谱共有峰1、2、4、7、9、11、13、18的峰面积差异有统计学意义（P<0.01），色谱峰6、12、14差异无统计学意义（P>0.05），见表1。Mann-Whitney U（二样本）检验结果表明，色谱峰3、5、15、16在当归与

油当归组间差异无统计学意义（P>0.05）。结合指纹图

谱可以看出，油当归色谱峰3、4、5、7、14、16的峰面积减小，色谱峰1、2、6、9、11、13、15、17、18的峰面积增加。色谱峰8、10可作为当归生品与油制品鉴别的特征性指标。指纹图谱共有峰峰面积当归与油当归比较（xˉ±s，n=10）表1 HPLC

峰号当归油当归

注：与当归比较，**P<0.01

2.5.2 聚类分析

将10批当归及油当归样品指纹图谱的16个共有峰峰面积（缺失的色谱峰峰面积以0计）导入微生信在线平台（http://www.bioinformatics.com.cn），聚类方法为ward.D2，距离选择euclidean，并采用Z-score法对数据进行标准化，绘制聚类热图，结果见图2。可以看出，样品可明显聚为当归及油当归2类：S1～S10为一类，J1～J10为一类，表明当归油炒后发生明显变化；观察和对比当归油炒前后各成分的变化趋势，当归油炒后峰1、2、9、11、13、17、18含量增加，峰3、4、5、7含量降低。2.5.3 主成分分析

将10批当归及油当归样品指纹图谱的16个共有峰峰面积（缺失的色谱峰峰面积以 0 计）导入SIMCA14.1软件，采用PCA进行分析，结果见表2、图3、图4。提取得到4个特征值>1的主成分，可用于反映当归和油当归特征图谱79.69%的信息，第1主成分变量的权重前5位依次为色谱峰17、18、9、11、1，由此判定这5个成分是当归、油当归的重要组成。PCA得分图显示，当归与油当归总体可聚为2类：S1～S10为一类，J1～J10为一类。与聚类分析结果一致。

表2当归与油当归主成分特征值及方差贡献率

2.5.4 正交偏最小二乘-判别分析

以10批当归、油当归样品各共有峰的单位峰面积为变量，采用SIMCA14.0软件，OPLS-DA建立的模型参数R2Y=0.97、Q2=0.94，表明模型对变量的解释能力和预测能力良好。OPLS-DA结果显示，10批当归、油当归样品可分为2类，与聚类分析和PCA结果一致，见图5。2.6 粉末色度值测定与分析

采用SC10型色差计，设置光源为D65；色彩空间为CIE，Lab；测量几何结构d/8º；侦测器为硅光电二Φ=4

极管；测量孔径 mm；定位方式为光照定位和十字架定位；光源为LED蓝光激发。为减少仪器误差，选定一张白纸为标准样品，样品色度值E* =（L*2+a*2+ ΔL* =L*酒当归-L*当归、Δa* =a*酒当归-a*当归b*2）1/2；按公式 、Δb*=b*酒当归-b*当归、ΔE Δ Δ Δ

* *2 *2 *2

=（ L + a + b ）分析油当归与当归总体颜色差异，结果见表3、表4。ΔE*值为6.10～ 12.37，表明可明显识别同批次当归与油当归；Δa*为4.33～7.88，平均值为5.96，表明炮制后红色加深；Δb*为-3.90～2.36，平均值为-1.82，表明炮制后蓝色加深。

表3当归及油当归样品粉末色度值测定结果

采用SPSS20.0软件对当归、油当归的色度值L*、a*、b*进行配对样本t检验，结果见表5。与当归比较，油当归L*、a*、b*差异有统计学意义，表明L*、a*、b*均可用于鉴别当归与油当归。

注：与当归比较，#P<0.05，##P<0.01

3讨论

本研究考察了不同提取溶剂（30%、50%、70%甲醇）和提取方式对色谱图的影响，结果发现，70%甲醇色谱峰数量最多、峰面积中等；提取方式选取超声提取与加热回流提取，结果发现二者色谱图接近，但超声提取操作简单快速，故选择用70%甲醇超声提取。

建立的10批当归与油当归指纹图谱相似度均大于0.9，说明实验所用不同批次的当归整体质量稳定，炮制后变化也相对稳定，分别标定16、18个共有峰，共指认6个成分。将其共有峰峰面积进行化学模式识别分析，聚类分析结果显示，可明显将其聚为当归与油当归两类，与PCA、OPLS-DA结果一致；在OPLS-DA中VIP>1的成分有峰5、峰7（绿原酸）、峰17、峰4、峰18（藁本内酯）、峰9（阿魏酸）、峰1、峰13、峰11 （洋川芎内酯I）、峰2、峰3，是当归油炒前后的差异性标志物。

ΔE∗为6～12个色差单位（1ΔE∗=1NBS）时，其当

ΔE*值为色差可被肉眼识别[6-7]，当归与油当归 6.10～ 12.37，表明可明显被肉眼鉴别；Δa*

平均值为5.96， Δb*平均值为-1.82，而a∗表示红绿方向，b*表示黄蓝方

向，表明炮制后红色、蓝色加深。

本研究采用HPLC建立指纹图谱，对当归油炒前后的化学成分进行定性定量分析，发现当归油炒后化学成分发生明显变化，与生品存在较大差异，筛选出未知成分峰1、2、3、4、5、13、17与已知成分绿原酸、藁本内酯、阿魏酸、洋川芎内酯I为差异性标志物，未知成分峰对应的化学成分还需后期采用对照品比对、液相色谱-质谱联用等方法进行鉴定。本研究基于指纹图谱和化学模式识别与色度值对比研究当归油炒前后的差异性，并筛选出差异性标志物，可为油当归炮制机理、药效物质基础研究提供依据，为进一步完善油当归质量标准提供参考，并为其临床应用及深入开发利用奠定基础。

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（收稿日期：2023-10-10） （修回日期：2023-11-02；编辑：陈静）

t/min 注：A.当归样品；B.油当归样品；C.混合对照品；7.绿原酸；9.阿魏酸；11.洋川芎内酯I；12.洋川芎内酯H；15.阿魏酸松柏酯；18.藁本内酯图1 10批当归和油当归HPLC指纹图谱

图2 当归及油当归样品聚类热图

图6 OPLS-DA模型置换检验根据变量重要性投影（VIP）>1，筛选出11种差异性指标成分，结果见图7。VIP值依次为峰5>峰7 （绿原酸）>峰17>峰4>峰18（藁本内酯）>峰9（阿魏酸）>峰1>峰13>峰11（洋川芎内酯I）>峰2>峰3，提示这些成分是当归油炒后变化的主要成分。

图5当归及油当归样品OPLS-DA得分图为避免建立的OPLS-DA模型出现过度拟合而影响分析结果的准确性，进行置换检验（置换次数为200次），结果见图6。R2和 Q2截距值分别为0.125 和-0.458，R2截距值<0.4、Q2截距值<0.05，表明所建模型可靠，未出现过度拟合现象。

图7 当归与油当归样品OPLS-DA色谱峰VIP