基于物质基础的雪上一枝蒿饮片及其水提物体内安全性比较研究

杨宏博，曹红云，张柏娥，李志玲，柳启涛，那敏，泰映玲，王京昆云南省药物研究所，云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111摘要：目的 建立HPLC同时检测雪上一枝蒿饮片6个乌头类生物碱含量的方法，比较饮片及其水提干膏粉的急性毒性反应特征和严重程度差异，为雪上一枝蒿饮片质量标准提高及合理使用提供依据。方法 采用Thermo Acclaim 120 C18色谱柱，以乙腈-四氢呋喃（5∶3，V/V）和0.1 mol/L醋酸铵溶液为流动相，梯度洗脱，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，测定雪上一枝蒿饮片及其水提干膏粉6个生物碱含量。将100只健康ICR小鼠随机分为溶媒对照组（0.5%羧甲基纤维素钠溶液），雪上一枝蒿饮片6.50、7.65 g/kg组及水提干膏粉10.33、12.15 g/kg组，给予相应药物后观察小鼠14 d内的中毒表观特征及死亡情况。结果 雪上一枝蒿炮制饮片及其水提干膏粉中苯甲酰乌头原碱的含量为0.10%和0.42%，其余5个生物碱均未检出。毒性试验结果表明，雪上一枝蒿饮片小鼠最大耐受剂量为6.50 g/kg（相当于临床人拟用剂量的7 831倍），其水提干膏粉小鼠最小致死剂量为30.99 g/kg（相当于临床人拟用剂量的193 688倍）。结论 本研究建立的HPLC同时测定雪上一枝蒿饮片及其水提干膏粉6个乌头类生物碱含量的方法线性关系良好且准确性高，雪上一枝蒿饮片水提干膏粉乌头类生物碱含量更高且安全性更好。关键词：雪上一枝蒿；炮制；物质基础；乌头类生物碱；急性毒性；安全性中图分类号：R284.1；R285.5 文献标识码：A文章编号：1005-5304(2024)05-0125-06 DOI：10.19879/j.cnki.1005-5304.202310450开放科学（资源服务）标识码（OSID）： Comparative Study on Safety of Processed Aconitum brachypoaum Diels. and

Its Aqueous Extract in Vivo Based on Material Basis

YANG Hongbo, CAO Hongyun, ZHANG Baie, LI Zhiling, LIU Qitao, NA Min, TAI Yingling, WANG Jingkun Yunnan Institute of Materia Medica, Yunnan Province Company Key Laboratory for TCM and

Ethnic Drug of New Drug Creation, Kunming 650111, China

Abstract: Objective To establish an HPLC method for simultaneous detection of six aconitum alkaloids in processed Aconitum brachypodum Diels.; To compare feature of the acute toxicity reaction and severity of the decoction pieces and its aqueous extract; To further provide a theoretical support for rising quality standards and reasonable use of Aconitum brachypodum Diels. Methods Six kinds of aconitum alkaloids of the decoction pieces and its aqueous extract of Aconitum brachypodum Diels. were separated on a Thermo Acclaim 120 C18 column, eluted gradually with mobile phase of acetonitrile-tetrahydrofuran (5∶3, V/V) and 0.1 mol/L ammonium acetate, with detected flow rate at 1.0 mL/min and column temperature at 30 ℃. 100 ICR mice were randomly divided into 5 groups, i.e. control group (0.5% CMC-Na solution), two processed Aconitum brachypodum Diels. groups in doses of 6.50 g/kg and 7.65 g/kg, two aqueous extract groups of processed Aconitum brachypodum Diels. in doses of 10.33 g/kg and 12.15 g/kg. Apparent symptoms and deaths of mice were observed every day in 14 days after administration of corresponding drugs. Results Benzoyl aconitine contents which detected in processed Aconitum brachypodum Diels. and its aqueous extract, were 0.10% and 0.42%, respectively, as well as other five aconitines were not detected in test基金项目：云南省重大科技专项（生物医药）课题（20181105）通讯作者：王京昆，E-mail：wjkyimm@163.com

substances. The results of toxicity test showed that the maximum tolerate dose (MTD) of processed Aconitum brachypodum Diels. in mice was 6.50 g/kg (equivalent to 7 831 times of proposed clinical dosage in human), while the minimum lethal dose (MLD) of its aqueous extract was 30.99 g/kg (equivalent to 193 688 times of proposed clinical dosage in human). Conclusion The established HPLC method for simultaneous detection of six kinds of aconitum alkaloids in decoction pieces and its aqueous extract of Aconitum brachypodum Diels. is well linear and accurate. Compared to processed Aconitum brachypodum Diels., its aqueous extract with higher aconitum alkaloids content has a better safety.

Keywords: Aconitum brachypodum Diels.; processing; material basis; aconitum alkaloids; acute toxicity; safety雪上一枝蒿又名铁棒锤、三转半，为毛茛科植物短柄乌头Aconitum brachypodum Diels.的干燥块根，味苦、辛，性温，有大毒[1]，具有祛风除湿、消炎镇痛功效，常用于治疗风湿疼痛、跌打损伤、牙痛等[2]。药理研究表明，雪上一枝蒿具有镇痛[3]、抗炎[4-5]、抗肿瘤[6]、抗生育[7]等作用，活性成分以乌头碱类、雪上一枝蒿甲素类等为主，其中双酯型乌头生物碱类毒性较大，口服用量不当易引起口唇和四肢麻痹、恶心、休克等不良反应或中毒症状[8]，故该药材多外用。内服一般先行炮制，使双酯型乌头碱类成分转化为具有药理活性且毒性更小的单酯型生物碱（苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱等）[9]，从而有效降低毒性、减少不良反应，还可增加其适应证和使用范围[10]。本研究建立HPLC测定雪上一枝蒿炮制饮片及其水提干膏粉6个生物碱含量方法，并以此为物质基础研究其毒性差异，从而为雪上一枝蒿饮片质量标准提高及其药材的合理使用提供依据。

1 仪器、试药与动物

Agilent 1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司； AG285电子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司； SK8200HP超声波清洗仪，上海科导超声仪器有限公司；N-1001旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司； JJ2000电子天平，美国双杰兄弟（集团）有限公司常熟市双杰测试仪器厂；YLS-27A大小鼠尾部自动标号仪，济南益延科技发展有限公司。

雪上一枝蒿药材，购于昆明市中药材专业市场（产地昭通），经云南省药物研究所天然药物资源研究室正高级工程师符德欢鉴定为毛茛科植物短柄乌头雪上一枝蒿Aconitum brachypodum Diels.的干燥块根，饮片由云南省药物研究所符合GMP要求的提取与制剂中试平台依据2020年版《中华人民共和国药典》四部“0213炮制通则”进行规范炮制获得，批号分别为YP20190909M、YP20190913M、YP20201201M。对照品苯甲酰新乌头原碱（批号111795-201303，纯度96.3%；批号111795-201604，纯度94.0%）、苯甲酰乌头原碱（批号111794-201304，纯度97.5%）、苯甲酰次乌头原碱（批号111796-201304，纯度94.6%）、乌头双酯型生物碱对照提取物（批号112029-201601，新乌头碱含量31.7%、次乌头碱含量30.0%、乌头碱含量31.8%），中国食品药品检定研究院。羧甲基纤维素钠（CMC-Na ），国药集团化学试剂有限公司，批号20180423；乙腈和四氢呋喃为色谱纯，德国默克；醋酸铵、二氯甲烷、异丙醇均为分析纯；纯水及超纯水均为本实验室自制。

SPF级ICR小鼠100只，6～8周龄，雌雄各半，体质量雌22.0～30.0 g、雄25.0～34.0 g，购自云南大学，动物许可证号SCXK（滇）K2021-0001，动物质量合格证号20220519。饲养于通过国家GLP认证的屏障环境动物实验室，采用PC透明饲养笼（28 cm× 16 cm×13.5 cm），雌雄分笼饲养，每笼5只。温度20～

40%～70%，换气次数≥15次/h，气流速度≤ 26 ℃，湿度

m/s，氨浓度（动态）≤14

0.2 mg/m3，12 h/12 h明暗交替，噪声≤60

dB。动物试验经本单位实验动物管理和使用委员会（IACUC）审查批准[动（伦） IACUC2022-0014-01]。

2 方法与结果

2.1 雪上一枝蒿饮片水提干膏粉制备

称取雪上一枝蒿饮片粉末1 000 g，分别用10倍量去离子水和8倍量去离子水回流煎煮2次（首次煎煮前浸泡60 min），每次煎煮1 h，过滤。2次煎液合并， （75±5）℃减压浓缩至相对密度≥1.12

g/mL，放入真空干燥箱干燥至恒重，粉碎，过三号筛，即得雪上一枝蒿饮片水提干膏粉（提取率为19.3%）。

2.2 混合对照品溶液制备

精密称取苯甲酰新乌头原碱对照品（批号111795201303）9.91 mg、苯甲酰次乌头原碱对照品10.15 mg、乌头双酯型生物碱对照提取物30.11 mg，分别置10 mL容量瓶中，加入异丙醇-二氯甲烷（1∶1）混合溶液溶解，定容至刻度，摇匀，即得混合对照品贮备液A。精密称取苯甲酰乌头原碱对照品20.43 mg并精密量取

2.0 mL混合对照品贮备液A，置10 mL容量瓶中，加异丙醇-二氯甲烷（1∶1）溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得含0.190 9 mg/mL苯甲酰新乌头原碱、1.99 2 mg/mL苯甲酰乌头原碱、0.192 0 mg/mL苯甲酰次乌头原碱、0.190 9 mg/mL新乌头碱、0.180 7 mg/mL次乌头碱和0.191 5 mg/mL乌头碱的混合对照品贮备液B。

2.3 供试品溶液制备

精密称取供试品粉末约2g，置具塞锥形瓶中，加氨水3 mL，加入异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，常温超声（功率300 W，频率50 kHz）处理30 min，放冷，过滤。精密量取续滤液25 mL，减压回收溶剂，残渣加入异丙醇-二氯甲烷（1∶1）混合溶液溶解，过滤后倒入5 mL容量瓶定容，即得。

2.4 色谱条件

采用Thermo Acclaim 120 C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 µm），流动相A为乙腈-四氢呋喃（5∶3， V/V）、B为0.1 mol/L醋酸铵溶液，梯度洗脱（0.0～ 2.6.2线性关系考察

精密称取对照品苯甲酰新乌头原碱（批号111795201604）10.23 mg、苯甲酰乌头原碱10.29 mg、苯甲酰次乌头原碱10.42 mg及乌头双酯型生物碱对照提取物（新乌头碱、次乌头碱和乌头碱） 33.33 mg，置10 mL容量瓶中，加异丙醇-二氯甲烷（1∶1）溶液溶解，定容至刻度，摇匀，制得浓度分别为0.961 6、1.003 3、0.985 7、1.056 6、0.999 9、1.059 9 mg/mL的混合对照品贮备液，随后再分别依次以0.5倍逐级稀释得6个浓度对照品溶液，按“2.4”项下色谱条件分别进样，测定峰面积，计算得到6个生物碱的回归方程及线性范围，R2值均为0.999 9[11]。6个生物碱对照品在

15%A→26%A； 26%A→ 48.0 min， 48.0～48.1min， 35%A； 48.1～58.0 min， 35%A； 58.0～65.0 min， 35%A→15%A）[12]

，流速 1.0 mL/min ，检测波长

μL。

235 nm，柱温30 ℃，进样量10

2.5 统计学方法

采用SPSS Statistics 24统计软件进行分析。计量资xˉ±s

料以 表示，组间比较采用方差分析，或非参数检验（Kruskal-Wallis H检验）。P<0.05表示差异有统计学意义。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性与系统适用性

取空白溶液（异丙醇-二氯甲烷1∶1）、混合对照品溶液和供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图1。供试品与对照品出峰位置相同，且空白溶液对6个生物碱对照品含量测定无干扰，色谱峰的理论塔板数、分离度、对称因子符合要求，表明本法专属性和系统适用性良好。2.6.3 检测限和定量限

取“2.6.2”线性关系考察配制的混合对照品贮备液，用异丙醇-二氯甲烷（1∶1）溶液稀释成一系列浓度的混合对照品溶液，按“2.4”项下色谱条件分别进

样，考察苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的检测限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10），结果见表2。2.6.4 精密度试验

精密称取6个生物碱对照品，按“2.2”项下方法制备混合对照品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD为 0.76%～ 3.10%，表明仪器精密度良好。

2.6.5 重复性试验

精密称取雪上一枝蒿饮片粉末供试品（批号YP20190909M）6份，每份约2g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样测定，记录各生物碱峰面积并计算RSD。苯甲酰乌头原碱和乌头碱平均含量分别为（0.101±0.002）%和（0.001± 0.000）%，RSD分别为1.95%和0.37%外，其他4个生物碱均未检出，表明该方法重复性良好。

2.6.6 稳定性试验

精密称取雪上一枝蒿饮片粉末供试品（批号YP20190913M）约2 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，于制备后0、2、4、8、12、24 h，按“2.4”项下色谱条件进样测定，记录各生物碱的峰面积并计算RSD。苯甲酰乌头原碱峰面积RSD=1.03%，其他5个生物碱均未检出，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.7 加样回收率试验

精密称取雪上一枝蒿饮片粉末供试品（批号YP20190909M）9份，每份约1g，设计3个浓度水平，每个水平3份，分别加入0.2、0.4、0.6 mL混合对照品贮备液B，再按“2.3”项下方法制备，按“2.4”项下色谱条件进样测定，结果见表3。平均加样回收率为92.89%～104.91%，该方法准确度符合2020年版《中华人民共和国药典》四部“9101分析方法验证指导原则”（含量0.1%加样回收率为90%～108%）的检测要求。

注：“－”表示未检出

2.6.8样品测定

精密称取雪上一枝蒿饮片粉末（批号YP20201201M）和水提干膏粉各约2g，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样测定，记录各生物碱的峰面积，计算两样品6个生物碱含量。结果表明，雪上一枝蒿炮制饮片粉末和水提干膏粉含苯甲酰乌头原碱分别为0.10%和0.42%，其他5个生物碱在两样品中均未检出。

2.7 安全性评价

2.7.1 给药剂量设置

将100只小鼠随机分为溶媒对照组，雪上一枝蒿饮片6.50、7.65 g/kg组（饮片组）及水提干膏粉10.33、12.15 g/kg组（水提物组），每组20只。给药前小鼠禁食不禁水12～15 h。24 h内，饮片6.50、7.65 g/kg组分别灌胃 0.16、 0.19 g/mL 雪上一枝蒿饮片（批号YP20201201M）药液1次，水提物10.33、12.15 g/kg组分别灌胃水提干膏粉0.26、0.30 g/mL药液3次，溶媒对照组灌胃0.5%CMC-Na溶液3次，给药体积均为40 mL/kg，给药间隔4h。见表4。

2.7.2 一般症状、体征和死亡情况

给药当日至给药后14 d，溶媒对照组各动物体征未见明显异常；除饮片组和水提物组分别出现惊跳反射和震颤外，均观察到与中枢神经、自主神经、感觉、

神经肌肉和胃肠道功能失调相关的稀便（红褐色）、活动减少、俯卧、流涎、张力下降（后肢）、呼吸急促、干呕和竖毛等全身性毒性症状、体征反应，随给药剂量和/或次数增加，反应症状种类增多、程度更严重，且具有明显剂量-反应关系。同时可见饮片组和水提物组存活动物出现的毒性反应症状分别在给药后1d和给药后3d完全消失，恢复正常。试验过程中，饮片 7.65 g/kg组和水提物10.33、12.15 g/kg组分别2.7.4 解剖及肉眼观察情况

饮片组及水提物组动物给药后，对中途死亡和观察期结束时存活的动物进行解剖，观察脏器、器官的体积、颜色、质地等，结果未见与受试药物相关的异常变化。

只（2♂）和 只（1♀）、3只（1♀/2♂）动物死亡。有2 1

见表5。

2.7.3 体质量变化情况

饮片组及水提物组存活的小鼠给药后14 d生长状态正常，平均体质量均明显增加，且与溶媒对照组比较，饮片组及水提物组给药当日和给药后各时间点小鼠平均体质量组间比较差异均无统计学意义（P> 0.05）。见图2。

3 讨论中药炮制是中医长期临床用药经验总结，指在中医理论的指导下，按中医用药要求将中药材加工成中药饮片的传统方法和技术，又称“修事”“修治”。药物经炮制后，不仅可以提高药效、降低药物的毒副作

用，而且具有方便存贮的特点。雪上一枝蒿生用有大毒，散剂、酒剂、片剂或水磨成浆内服均有中毒的危险，故使用前应进行炮制。目前，经查阅文献可知，雪上一枝蒿炮制减毒的方法主要有水泡、水煮、甘草

制、油制、童尿制、醋制等[12-13]。本研究主要基于云

南省药物研究所开发的雪上一枝蒿炮制方法，建立HPLC方法，对雪上一枝蒿饮片和水提干膏粉中3个毒性较大的双酯型乌头碱类和3个毒性较小的单酯型乌头碱类含量的变化情况进行分析，并以此为物质基础，进一步对雪上一枝蒿炮制饮片与其水提干膏粉毒性差异进行比较，从而为雪上一枝蒿饮片的质量标准提高及其药材的安全使用提供依据。

通过6个生物碱含量测定研究可见，雪上一枝蒿炮制饮片及水提干膏粉双酯型乌头碱类均未检出或低于检测下限，而单酯型生物碱两者仅检测到苯甲酰乌头原碱，水提干膏粉中的含量（ 0.42% ）较其饮片（0.10%）明显升高。同时，与曹红云等[11]对炮制前雪上一枝蒿相应生物碱的含量测定结果比较，炮制后双酯型乌头碱类含量明显降低，而单酯型生物碱含量明显增加。表明雪上一枝蒿经炮制后，毒性较大的双酯型乌头碱类成分明显下降或消失，仍具有药理活性的

单酯型生物碱类成分[14-15]则明显提升，且通过水提后

其含量会进一步提高。

毒性试验结果显示，雪上一枝蒿饮片及水提干膏粉给药后均观察到小鼠与中枢神经、自主神经、感觉、神经肌肉和胃肠道功能失调等相关的中毒反应症状，推测其小鼠最小致死剂量（ MLD ）分别为 6.50～ 7.65 g/kg（相当于临床人拟用剂量的7 831～9 217倍）和30.99 g/kg（相当于临床人拟用剂量的193 688倍），

与江林等[13]研究所获得的炮制前雪上一枝蒿的小鼠半

数致死量（LD50）0.66 g/kg相比，经炮制后的雪上一枝蒿饮片及其水提干膏粉的毒性明显下降，其用药安全性明显提高。

结合HPLC测定结果可见，虽然水提干膏粉单酯型生物碱（苯甲酰乌头原碱）的含量是雪上一枝蒿饮片的4倍，而水提干膏粉的安全性远高于原雪上一枝蒿饮片（约24倍）。由此可见，雪上一枝蒿中所含的单酯型生物碱（苯甲酰乌头原碱）安全性较高，且通过炮制和水提可有效降低双酯型生物碱的含量，并增加单酯型生物碱的含量，而经炮制后的雪上一枝蒿可能仍存在一些除上述6个生物碱外其他毒性相对较大的成分，通过水提后得到进一步去除，使其毒性进一步下降。为提高雪上一枝蒿饮片的质量标准及其药材使用安全性，需对其饮片有毒成分进行更加深入的研究，从而更好地了解有毒成分在炮制和水提过程中的变化规律。

参考文献：

[1] 吴玉梅,陈晓兰,魏文珍,等.雪上一枝蒿的研究进展[J].黔南民族医

专学报,2015,28(2):98-100,118.

[2] 杨立国,夏伟军,唐梦云,等.雪上一枝蒿化学成分和药理作用研究概

况[J].云南中医学院学报,2016,39(6):95-97,102.

[3] 魏文珍,吴玉梅,唐红艳,等.雪上一枝蒿药材及其制剂发挥镇痛作用

的治疗窗研究[J].贵阳中医学院学报,2016,38(3):23-28.

[4] 黄先菊,任炜,潘乐,等.雪上一枝蒿醇提物体外抗炎作用的研究[J].

中南民族大学学报(自然科学版),2012,31(4):36-40.

[5] 罗成月,陈晓兰,杨敬洪,等.雪上一枝蒿总生物碱抗关节炎作用机制

研究[J].贵州科学,2020,38(1):51-53,93.

[6] 刘淑萍,张新渐,王洪云,等.乌头属中药多糖研究进展[J].中国药业,

2019,28(3):1-6.

[7] 白一岑,李艳杰,马云淑.石菖蒲、肉豆蔻、橘皮挥发油对雪上一枝蒿

总碱经皮渗透的影响[J].中国中医药信息杂志,2008,15(2):38-40. [8] 谢伟,周昆,刘洋,等.雪上一枝蒿毒性研究概况[J].中国民族民间医

药,2018,27(23):65-68.

[9] 王东孝.雪上一枝蒿化学成分与药物质量控制研究[D].郑州:河南大

学,2013.

[10] 曹红云,牛延菲,秦波,等.正交试验优选雪上一枝蒿中乌头碱的提取

工艺[J].云南中医中药杂志,2015,36(12):64-67.

[11] 曹红云,何雨桐,牛延菲,等.高效液相色谱法同时测定雪上一枝蒿中

6种乌头属生物碱含量[J].广州化工,2021,49(8):93-96.

[12] 牛延菲,曹红云,徐怡,等.不同产地及炮制方法雪上一枝蒿中雪上一

枝蒿甲素含量对比研究[J].广州化工,2020,48(24):115-118.

[13] 江林,胡元聪.雪上一枝蒿炮制方法的探讨[J].中成药研究,

1985(12):18-19.

[14] 邵鑫,蒋先虹,王瑞.苯甲酰乌头原碱对类风湿关节炎患者外周血单个核细胞凋亡、炎症因子的影响[J].风湿病与关节炎,2022,11(7):711,23.

[15] 姜奕甫.单酯型乌头类总生物碱的制备方法及其应用研究[D].长春:

吉林大学,2018.

（收稿日期：2023-10-25） （修回日期：2023-11-10；编辑：陈静）