Simultaneous Determination of 10 Kinds of Mycotoxins in Liquor-Making Raw Materials by HPLC-MS/MS

ZHOU Hanling, LIAO Qinjian, SONG Tingfu, AN Mingzhe, LI Yanghua, WANG Fang, GUO Yan, WANG Xiaoqin and LUO Zhu (Technology Center of Wuliangye Group Co. Ltd., Yibin, Sichuan 644007, China)

Liquor-Making Science and Technology - - Contents - ZHOU Hanling

Abstract: A method for simultaneous determination of 10 kinds of mycotoxins in liquor-making raw materials by HPLC-MS/MS had been developed. The samples were extracted with 84 % acetonitrile. Four kinds of aflatoxins were quantified by external standard method with aflatoxin immunoaffinity column purification, and the other six mycotoxins were quantified by internal standard method with multi- functional column purification. The results showed that the 10 mycotoxins had a good linear relationship in their respec

μg/ tive linear range with a correlation coefficient no less than 0.998. The detection limits of the 10 compounds were 0.0022 L to

μg/ μg/ μg/ 1.79 L with the limits of quantitation as 0.075 L to 5.95 L. The recoveries were 61 % to 116.2 % with the relative standard deviations as 0.88 % to 8.61 %. This method had the advantages including high sensitivity, good stability and quantitative accuracy, and it was suitable for quantitative detection of various mycotoxins in different liquor-making raw materials. Key words: high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry; liquor- making raw materials; mycotoxins; multifunctional column; immunoaffinity column

真菌毒素( Mycotoxins)是某些真菌产生的二级代谢产物,目前已知的真菌毒素有 300 多种,在粮食谷物中较受关注的真菌毒素主要有黄曲霉毒素( Aflatoxins)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A)、脱氧 雪腐镰刀菌烯醇( Deoxynivalenol,DON)、玉米赤霉HT- HT- T-烯酮( Zearalmone,ZEN)、 2毒素( 2)、毒2 T-素( 2)、展青霉素( patulin,PAT)、杂色曲霉毒素( Sterigmatocystin,ST)等,其中,粮食中污染的黄曲

霉毒素主要有黄曲霉毒素 B1(Aflatoxin B1, AFB1)、黄曲霉毒素B2(Aflatoxin B2,AFB2)、黄曲霉毒素 G1(Aflatoxin G1,AFG1)和黄曲霉毒素G2 ( Aflatoxin G2,AFG2)4种 。真菌毒素被归类为比

[1]合成污染物、食品添加剂或农药残留更重要的食源性风险因子,其中,黄曲霉毒素B1被公认为是目前

[2]具有强致癌力的天然物质之一 。真菌毒素广泛存在于以粮谷为原料的食品和饲料中,我国针对食品中的真菌毒素制订了限量标准,对食品中黄曲霉毒素B1的最高允许量为:玉米、花生及其制品中不得

μg/ μg/超过20 kg;大米及食用油类不得超过10 kg;

μg/其他粮食、豆类及发酵食品中不得超过5 kg;小麦、面粉、玉米及玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇不

μg/得超过1000 kg;小麦、玉米中玉米赤霉烯酮的

μg/限量为60 kg[ 。

3]真菌毒素的检测方法有酶联免疫法( ELISA)、薄层层析色谱法( TIC)、液相色谱法( HPLC)、液相

LC-与质谱联用检测法( MS)等。ELISA法具有前处理简单、特异性强、灵敏度高等特点,但是该方法存在一定的假阳性; TIC法无需昂贵设备,成本低,但是操作复杂,精确度低; HPLC法稳定性好、灵敏度高,但是该法只依靠保留时间定性,存在一定的假阳性,且该法一次只能检测同一类毒素,无法做

LC-到多种真菌毒素的同时检测。 MS法依靠目标化合物的保留时间和分子结构信息定性,准确性好,具有灵敏度高、杂质影响小的特点,可同时分析

[ 5]多种真菌毒素4- 。本试验采用黄曲霉毒素免疫亲和柱和多功能柱对样品进行净化,利用高效液相色

-谱串联质谱分析,其中, AFB1、AFB2、AFG1、

HT- T- AFG2 采用外标法定量, 2、 2、、ST DON、ZEN、PAT这6种毒素使用内标法定量,方法稳定性好,灵敏度高,适用于酿酒原料中多种真菌毒素的分析。 1 材料与方法 1.1 材料、试剂及仪器原料样品:小麦、大米、玉米、糯米、高粱,五粮液股份有限公司提供。仪器设备: 5500三重四极杆液相质谱仪(美国 87应用生物系统公司); 5810R冷冻离心机(德国 Ep- pendof 公司);百分之一天平(梅特勒托利多公-司);十万分之一天平(梅特勒 托利多公司);振荡器(德国IKA公司);固相萃取仪(上海安谱有限公司);旋风磨(福斯公司);超纯水制备仪(美国Millipore公司)。LC-试剂耗材:甲醇( MS 级,美国 Merck 公司);甲酸(美国 fisher 公司);真菌毒素标准品: HT- T- AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、 2、 2、、ST DON、ZEN、PAT(99 %,百灵威试剂公司);真菌毒素同位13C22- HT- 13C24- T- 13C18- 13C7-素内标: 2、 2、 ST、 PAT、13C15- 13C18- DON、 ZEN(25.1 mg/L,Romer 公司),真菌毒素免疫亲和柱( Romer 公司); Mycosep 226 多功能净化柱( Romer公司)。1.2 标准溶液的配制真菌毒素标准溶液的配制:分别准确称取HT- T- AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、 2、 2、、ST DON、ZEN、各PAT 0.00010 g,分别以甲醇定容至10 mL,配成浓度为 100 mg/L的储备液;称取 0.00010 g PAT,以 0.2 %甲酸水溶液定容至10 mL,配成浓度HT- T为100 mg/L的储备液,分别吸取一定量的 2、2、ST、DON、ZEN、PAT标准储备液,以甲醇定容至5 mL,配制混合标准溶液( 1),混合标准溶液( 1)中HT- T- 2、 2、ST、DON、ZEN、PAT浓度分别为1 mg/L、μg/ μg/ 1 mg/L、40 L、40 L、10 mg/L、2 mg/L。分别吸取一定量的AFB1、、AFB2 AFG1、AFG2标准储备液,以甲醇定容至5 mL,配制混合标准溶液( 2),混合标准溶液( 2)中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2浓度μg/均为200 L。真菌毒素同位素内标的配制:分别吸取一定量13C22- HT- 13C24- T- 13C18- 13C18- 13C7的 2、 2、 ST、 ZEN、13C15- PAT、 DON标准溶液,各以甲醇定容至5 mL,制备内标储备液,使得各内标浓度分别为1 mg/L、μg/ μg/ 1 mg/L、100 L、100 L、1 mg/L、1 mg/L。以20 %甲醇稀释混合标准溶液( 1)和混合标准溶液( 2),配成一系列的标准溶液,每个标准溶液13C22- HT- 13C24- T- 13C18- 13C18-中含有 2、 2、 ST、 ZEN、13C7- 13C15- μg/ μg/ PAT、 DON浓度分别为10 L、10 L、μg/ μg/ μg/ μg/ 0.5 L、0.5 L、20 L、100 L。

液相色谱、质谱条件液相色谱条件:色谱柱: C18柱( 100 mm×2.1 mm, μm), 1.8 相: A:5 mmol/L甲酸铵溶液, B:甲醇。洗脱梯度: 0 min,80 % A;5 min,50 % A;7~10 min, 2 % A;11~15 min,80 % A。流速: 0.2 mL/min。柱

μL温: 30 ℃。进样体积: 5 。

质谱条件:电喷雾离子源( ESI);检测方式:多离子反应监测( MRM);毛细管电压: 5500 V ( ESI+),4500 V(ESI-);气帘气: 35 psi;碰撞气: 8 psi;离子源温度: 550 ℃;加热气1:55 psi;加热气2: 55 psi。其他质谱采集参数见表1。1.4 样品前处理

样品前处理( 1):称取粉粹后的样品5.00 g,加入一定量的6种真菌毒素同位素内标,加入84 %的乙腈20 mL,振荡1h后 8000 r/min 离心10 min,取上清液8 mL于 Mycosep 226多功能柱的套管中,缓慢将柱芯推入试管底部,取4 mL套管中的净化液,50 ℃下 N2吹至干,以 20 %甲醇定容至1 mL,

μm LC-涡旋混匀,过0.22 滤膜,进 MS/MS分析6种

[6]毒素含量 。

样品前处理( 2):称取粉粹后的样品 5.00 g,加入84 %的乙腈20 mL,振荡1h后以8000 r/min离心10 min,取上清液4 mL,加入PBS缓冲液( pH7.4,含1 % tritonX 100)46 mL,以约2 mL/min的速度上黄曲霉毒素免疫亲和柱,待样液滴完后,以2×10 mL超纯水淋洗免疫亲和柱,抽干,以 2×1 mL甲醇洗脱,抽干,收集全部洗脱液,50 ℃下N2吹至干,以

μm 20 %甲醇定容至1 mL,涡旋混匀,过0.22 滤膜,

LC-进 MS/MS分析4种黄曲霉毒素含量 。

[7]

结果与分析

2.1 流动相的选择- - -本实验考察了乙腈 水、甲醇 水、乙腈 0.1 % - -甲酸水、甲醇 0.1 %甲酸水、乙腈 5 mmoL/L甲酸-铵、甲醇 5 mmoL/L甲酸铵作为流动相的结果,实验表明,以甲醇作为流动相时,质谱信号强于以乙- -腈作为流动相时的质谱信号,以甲醇 水、甲醇- 0.1 %甲酸水、甲醇 5 mmoL/L甲酸铵作为流动相时,标准品的质谱信号强度相差不大,但是,以甲 -醇 5 mmoL/L甲酸铵作为流动相时,样品中目标- -化合物信号明显强于以甲醇 水、甲醇 0.1 %甲酸水作为流动相时的信号。因此,最终选择甲-醇 5 mmoL/L甲酸铵作为本实验的流动相。2.2 质谱条件的选择本实验对10种真菌毒素及6种同位素内标的离子化方式、去簇电压、碰撞电压等进行了优化,结果见表1。

理,其原理是提取液通过不同类型的吸附剂装填而成的柱体,吸附剂吸附杂质而不吸附目标物,从而达到样品净化的目的,在本实验中,采用 Mycosep 226多功能净化柱对高粱、玉米、小麦、大米、糯米样品进行净化,不用内标校正时,10种真菌毒素回收率偏低,均低于65 %,其原因可能是吸附剂对真菌毒素有一定的吸附作用,也可能是多功能柱除杂不完全,基质中杂质对测定有一定的干扰,因此,本

13C22- HT- 13C24- T- 13C18实验采用6种同位素 2、 2、

13C7- 13C15- 13C18- HTST、 PAT、 DON、 ZEN分别作为

T- 2、 2、ST、PAT、DON 、ZEN的内标;而市场上所售黄曲霉毒素同位素标品浓度低,价格昂贵,不适用于企业大量样品的监测,因此,在本实验中,4种黄曲霉毒素采用外标法进行定量,所采用的预处理柱为黄曲霉毒素免疫亲和柱,使用1支免疫亲和柱即可处理1个样品中的4种毒素,结果稳定,方法可靠。2.4 方法的线性范围、检出限与定量限HT- T-

2、 2、ST、ZEN、DON、PAT采用内标法定量,以待测化合物和各自的峰面积为纵坐标,以待测化合物的浓度为横坐标进行回归分析, AFB1、AFB2、AFG1、AFG2采用外标法定量,以待测化合物峰面积为纵坐标,以待测化合物的浓度为横坐标进行回归分析,得到线性方程和相关系数,分别取空白高粱粉和大米粉作为基质,添加不同量的混合标准溶液( 1),按1.4中样品前处理( 1)处理,添加不同量的混合标准溶液( 2),按 1.4中样品前处理( 2)处理,分析测定后,按照 S/N=3计算各化合物的检出限,按S/N=10计算各化合物的定量限,结果见表 2,10种真菌毒素及6种同位素内标MRM色谱图见图1至图18。

图4 AFG1 MRM色谱图

从表2可看出,10种真菌毒素在各自的线性范围内,线性关系良好,相关系数( R)均不低于0.998,各种真菌毒素的检出限及定量限低,能满足日常测样的要求。2.5 加标回收率及精密度实验

13C18-图18 ZEN MRM色谱图混合标准溶液( 1)和混合标准溶液( 2),分别按照1.4中前处理方法( 1)和前处理方法( 2)处理,进行加标实验,每个加标水平平行测定5次,计算各种

真菌毒素的回收率和精密度,结果见表3,采用内标法定量的6种真菌毒素在3个水平下平均加标回收率为77.96 %~116.2 %,相对标准偏差为0.88~ 4.83。采用外标法定量的4种黄曲霉毒素在3个水平下平均加标回收率为61 %~102.7 %,相对标准偏差为1.11 %~8.61 %,其中, AFB2前处理损失最大,加标回收率相对较低,为61 %~76 %,AFG2加标回收率最好,为85.0 %~102.7 %。2.6 实际样品的测定

按上述建立的检测方法对五粮液公司酿酒所使用的高粱、玉米、小麦、大米、糯米中真菌毒素含量进行了检测,结果表明,5种酿酒原料中均未检 出上述10种真菌毒素。 3 结论

-建立了基于高效液相色谱 串联质谱技术的酿酒原料中10种真菌毒素的检测方法,使用黄曲霉毒素免疫亲和柱和Mycosep 226多功能柱可实现高粱、玉米、小麦、大米、糯米中10种毒素的净化。实验表明,该方法灵敏度高,稳定性好,适用于酿酒原料中10种真菌毒素的检测。

参考文献

: - [1] 廉慧锋,赵笑天, 王蓉珍,等.超高效液相色谱 串联质谱法同时测定玉米、花生、麦仁中的9种真菌毒素[J].食 (下转第94页)

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