Effects of Phanerochaete chrysosporium Pretreatment on Enzymatic Saccharification of Distillers Grains

Liquor-Making Science and Technology - - Contents - PEI Fangxia(

PEI Fangxia (Qiannan Grain and Oil Quality Testing Center, Duyun, Guizhou 558000, China) Abstract: Distillers grains (DG), composed of unhydrolyzed and unfermented polymeric sugar, is the co-product in distilleries. In this study, the effects of Phanerochaete chaysosporium pretreatment on enzymatic saccharification of distillers grains were explored. The results suggested that, as the inoculating quantity of P. chaysosporium was 3 % and the culture time was 8 d, the yield of reducing sugar and xylose reached the maximum of 60.55 % and 21.33 %, and the holocellulose retention rate and lignin degradation rate were 76.85 % and 26.44 % respectively. Besides, SEM and XRD results revealed that there were significant changes in the structure of distillers grains after P. chaysosporium pretreatment including destroyed wood fiber network structure, irregular puffing state in various shapes, and increasing porosity etc., which were helpful for enzymatic saccharification of distillers grains. Key words: distillers grains; Phanerochaete chaysosporium; pretreatment; enzymatic saccharification

随着化石能源的日益枯竭,生物能源的开发不仅有助于缓解日益严重的能源危机,还能减轻对地球温室效应和雾霾天气影响。木质纤维生物质各组分结构复杂,彼此关联。纤维素和半纤维素链内和链间主要通过氢键连接,木质素内部除了有强大的氢键连接外,还与半纤维素形成稳定的木质素-碳水化合物复合体。三者相互交织的结构决定了 任何一类成分的降解必然受到其他成分的制约,如木质素对纤维素和半纤维素酶解过程的空间位阻作用,很难使水解酶直接作用于底物,导致酶解效

[1]率和糖得率较低 。因此,需要通过预处理技术破坏木质纤维素的致密结构,改变木质素与半纤维素周围的基质结构,提高酶与底物的接触面积,使其在酶作用下降解为可发酵糖,这也是燃料乙醇转化

[2]的关键步骤和技术瓶颈 。

近年来在关于白腐真菌预处理的研究报告中,部分研究者认为,白腐菌预处理后酶解率提高的主要原因可能是预处理过程增加原料的多孔性,降低其结晶度,导致部分木质素被去除,木质纤维原料网络结构遭到破坏,增加酶与底物的可及性,使碳

[ 5] [6]水化合物转化为还原糖的转化率提高3- 。Sun等研究T. hirsuta yj9预处理对玉米秸秆酶解效果的影响时发现, T. hirsuta yj9预处理42 d后秸秆中木质素的降解率达到71.49 %,最主要的木质素降解和水解酶漆酶和木聚糖酶的滤纸酶活性随着处理时间的增加逐渐增加。

本实验主要对白腐菌生长曲线、白腐菌固态发酵时间对酒糟组分及酶解效果的影响进行研究,以及白腐菌结合超声波预处理的酒糟进行纤维素酶和木聚糖酶的水解,评价白腐菌预处理酒糟对纤维素酶和木聚糖酶水解的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂酒糟,甘肃金徽酒股份有限公司提供,自然晾干后粉碎过40目筛备用。主要组分成分为:纤维素 27.42 %,木质素9.7 %,半纤维素21.86 %,蛋白质12.45 %,脂肪3.02 %,灰分9.05 %(以干基计)。黄孢原毛平革菌( P.chaysosporium),购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。纤维素酶(滤纸酶活力为10万U/g)和木聚糖酶(酶活力为5万 U/g),宁夏和氏璧生物技术有限公D-司;间苯三酚,上海蓝季科技发展有限公司; 木糖,天津市光复精细化工研究所;其余试剂为分析纯。1.2 主要仪器HH- 4数显恒温水浴锅,国华电器有限公司; GZX- 9240 MBE数显鼓风干燥箱,上海博讯实业有限公司医疗设备厂; Cary50紫外可见分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;恒温振荡培养箱,上TG16-海精密科学仪器有限公司; WS高速台式离SB-JC-心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司; IB超净工作台,上海博讯实业有限公司医疗设备厂; SHZ-

82恒温培养箱,江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。1.3 实验方法1.3.1 菌种保藏

将P.chaysosporium接种于PDA培养基上,于恒温培养箱30 ℃培养,待白色的孢子铺满平板时,将平板转移至4 ℃冰箱中保存备用,每月接种1次。1.3.2 菌种培养1.3.2.1 培养基的制备

[7]固体培养基(即PDA培养基)( g/L):马铃薯提取液 1.0 L、葡萄糖 20.0,KH2PO4 3.0,MgSO4 · 7H2O 1.5,酵母膏0.1,琼脂15.0,pH6.0。

液体基础培养基( g/L):KH2PO4 20.0,MgSO4 · 7H2O 5,CaCl2 1。

微量元素混合液( g/L):氨基乙酸 1.5,MgSO4 · 7H2O 3,MnSO4 · 7H2O 0.5,NaCl 1.0,FeSO4 · 7H2O 0.1,CoCl2 · 6H2O 0.1,ZnSO4 · 7H2O 0.1,CuSO4 · 5H2O 0.1,KAl(SO4) · 12H2O 10 mg/L,H3BO4 10 mg/L,

2 Na2MoO4 · 2H2O 10 mg/L,pH 6.5。液体产酶培养基( g/L):葡萄糖10.0,酒石酸铵

mμ 2.0,维生素B 11.2,400 藜芦醇1 mL,0.2 M醋酸钠缓冲液( pH4.5)100 mL,液体基础培养基100 mL,微量元素混合液50 mL。1.3.2.2 菌悬浮液的制备

在无菌条件下,用接种环将PDA平板培基上的菌膜刮到无菌水中,30 ℃振荡培养2h后,用脱脂棉过滤,得到孢子悬浮液,用血球计数板测定菌悬液中的菌落单位数,测定菌悬液浓度在 5× 105 cfu左右。1.3.3 生物量的测定(以菌体干重计) 1.3.3.1 制备具有酶活性的菌液

将配制好的液体产酶培养基分装到20个100 mL的锥形瓶中,各装 50 mL,用透气膜封口,在121 ℃、101 kPa下灭菌20 min,然后用移液枪移取2 mL菌悬液于其中的18个锥形瓶中,另外两个作为对照组,将接种菌液的锥形瓶放置在30 ℃振荡培养箱中( 150 r/min)进行摇床培养,每隔12 h测定1次生物量。1.3.3.2 生物量的测定

将液体产酶培养基中的菌丝体用真空泵抽滤,抽滤前滤纸片烘干后的质量计为m1,菌体和滤纸

m2-恒重后的质量计为m2,则菌体干重为: m= m1。1.3.3.3 制作生长曲线

生物量增长最快的点为菌体对数期生长点,选该时间点为最佳产酶期。1.3.4 P.chaysosporium处理

准确称取10 g酒糟于250 mL锥形瓶中,按1∶ 2.5(m/v)的比例加入液体产酶培养基,用封口膜封口后,121 ℃高温灭菌20 min,制成固态发酵培养基。接种菌悬液,保持接种量为30 %(g∶mL),封口后,将锥形瓶移入30 ℃恒温培养箱中培养,培养时间分别为2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d,所有样品均设3 个平行实验。发酵结束后,将锥形瓶放入105 ℃干燥箱中烘干至恒重,粉碎后用自封袋保存待测。1.3.5 酶解处理

准确称取2.0 g预处理残渣,纤维素酶和木聚糖酶添加量为5000 U/g和4000 U/g进行酶解,酶解液用于测定还原糖和木糖浓度。 2 结果与分析

图1 P.chaysosporium生长曲线

由图1可知,在P. chaysosporium接种初期处于休眠状态,随着培养时间的延长,菌丝体重量开始缓慢增加,但当培养时间达到120 h时,随着培养时间的延长其干重增长迅速,且在132 h时增长最快,说明菌体进入对数生长期,在该阶段菌体生命力旺盛,是最佳接种期,当培养时间到156 h后,菌丝体 干重达到最大,并在156~192 h内基本保持不变,即产生次级代谢产物,进入产酶阶段。当培养时间超过192 h时,菌丝体干重急速下降,说明菌体开始衰亡。菌种活性直接关系到发酵液中酶活的高低。为了提高酶解效果,接种时间应选在菌体对数期,因此该菌体的接种种龄为120 h[。

8] 2.2 P. chaysosporium预处理时间对酶解效果的影响(图2)

由图2可看出, P. chaysosporium预处理时间对预处理效果的影响意义重大。固态发酵时间在0~ 8d范围内,随着预处理时间的延长,还原糖和木糖得率呈逐渐增加趋势,但是相对木糖得率而言还原糖得率增加趋势明显。当处理时间为8d时,预处理样品酶解液中还原糖和木糖得率达到最大值,分别为 60.55 %、21.33 %。继续延长预处理时间,还原糖和木糖得率逐渐下降。可能的原因是,过长的预处理时间导致木质素被降解,致使更多的纤维素暴露出来利于与酶结合,提高酒糟中纤维素和半纤

[9]维素与酶的可及性,从而提高酶水解得率 。2.3 P. chaysosporium预处理对酒糟组分的影响

由表1可知,随着P. chaysosporium预处理时间的延长,综纤维素保留率和木质素降解率均呈先增加后减小的趋势,且在培养时间为8d时,综纤维素保留率和木质素的降解率最好,分别为 76.85 %和26.44 %。同时造成综纤维素部分损失。谢菊兰

[10]在用白腐真菌降解稻草木质纤维素的研究中表明,稻草接种菌 F1 和 F2 后木质素的降解率可达39.32 %和34.29 %。黄慧等 研究P. chaysosporium

[11]对玉米秸秆木质素的降解时发现,在秸秆粒度4~ 5 cm,接种黄孢原毛平革菌培养35 d后,木质素降

图3 酒糟P. chaysosporium预处理及酶解残渣电镜扫描图(×2000)

解率累计率为45.2 %。2.4 酒糟 P. chaysosporium 预处理前后结构变化分析2.4.1 电镜扫描( SEM)分析(图3)

由图3可知,与酒糟原料相比经P. chaysosporium预处理后残渣、木质纤维结构发生明显变化,表面出现凹槽、不规则孔洞和部分脱落碎屑,结晶区和非结晶区界限模糊。残渣经酶解处理,原有的木质纤维结构进一步变得疏松,纤维素分子无定形区消失,结晶区表面被完全破坏。2.4.2 X衍射( XRD)分析(图4)

2θ根据图 4 可知,酒糟在 为 13.10°、21.90°和

2θ= 25.99°处有3个衍射峰,其中 13.10°处左右的弱

,2θ=峰代表纤维素无定形区 21.90°代表结晶区强度的002面衍射峰。经P. chaysosporium 预处理及

2θ=酶解后纤维素无定型区消失,在 22°附近处出现

[12]衍射峰,但峰尖不再尖锐 。利用 Segal经验公式得酒糟原料、P. chaysosporium处理残渣、酶解残渣的结晶度分别为25.21 %、50.40 %和 43.67 %。表 明预处理和酶解能够提高酒糟相对结晶度,可能的原因是,预处理使得木质纤维结构破坏,纤维素分子暴露,尤其是结晶区的暴露导致002面衍射峰强度增强,结晶度提高。2.4.3 红外光谱( FTIR)分析(图5)

由图5红外光谱分析可知,酒糟经 P. chayso-

sporium预处理后在1310 cm- 、1030 cm- 和833 cm-

1 1 1处的吸收峰发生变化明显,而此处的吸收峰分别代

C- C-表 H弯曲振动和纤维素分子内醚的 C骨架的伸缩振动,由上述吸收峰的归属可知酒糟中含有木质素、纤维素和半纤维素等成分,复合木质纤维生物质特征。酒糟经P. chaysosporium预处理及酶解后有明显的芳香环骨架振动伸缩振动峰1640 cm- 1,故可知P. chaysosporium预处理及酶解过程并未破坏木质素芳香环结构。酒糟经P. chaysosporium 作用及酶解后,在1030 cm- 处吸收峰明显减弱,说明

1半纤维素被部分降解,故可知, P. chaysosporium 处理及酶解前后的谱峰位置基本一致,但吸收峰强度

[13]发生变化,说明酒糟的结构被修饰 。

3 结论

研究结果表明,随着 P. chaysosporium 预处理时间的延长,酶解液中还原糖和木糖得率均呈先上升后下降的趋势,且在P. chaysosporium固态发酵时间为8d时,酶解液中还原糖和木糖得率达到最大值,分别为60.55 %和22.12 %,与未处理组相比,增长率分别为49.22 %和25 %。此时预处理残渣中综纤维素的保留率和木质素的降解率分别为76.85 %和26.44 %。

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2.1 黄孢原毛平革菌接种菌龄的确定(图1)

图2 P. chaysosporium预处理对酶解效果的影响

图 4 酒糟P.chaysosporium预处理及酶解前后X衍射图谱

P. chaysosporium预处理

酒糟原料

预处理后酶解

图5 酒糟P. chaysosporium预处理及酶解前后红外光谱图

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