Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine
当飞利肝宁胶囊对CCl4诱导的非酒精性脂肪性肝病大鼠急性肝损伤肝组织SIRT1/NF‑κB/p53信号通路的影响
1，2，宋海燕1 1，续嗣钰1，杨丽丽1 1，王倩蕾1，3周岐鸣 ，刘 洋 ，柳 涛
1. 200032）；2. 321100）；上海中医药大学附属龙华医院脾胃病研究所（上海 兰溪市中医院肾内科（浙江 兰溪
3. 201316）上海中医药大学附属龙华医院脾胃病二科（上海［基金项目］国家自然科学基金项目（82274386） ［作者简介］周岐鸣，男，硕士，医师，主要从事中医内科疾病临床和研究工作［通信作者］王倩蕾，副主任医师，硕士研究生导师； E-mail：qianleilh@126.com 1（SIRT1）调控的炎症和凋亡相关信号通路，探讨当飞利肝宁胶囊改善四氯化碳【摘要】目的基于沉默信息调节因子
（CCl ）诱导的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠急性肝损伤的作用机制。方法 Wistar
雄性 大鼠按体质量随机分为正常4 （N）组、NAFLD模型（HF）组、正常加CCl N-CCl4）组、NAFLD CCl HF-CCl4）组和当飞利肝宁胶囊（DF）组。N N-CCl4
（4 加 （4 和 组大鼠给予普通饲料，HF、HF-CCl4 DF组均给予高脂饲料，DF组同时予当飞利肝宁胶囊（0.3 g·kg-1）每天灌胃干预。8
组及 周后，除N HF CCl4。48 h后取大鼠血清和肝组织。检测指标包括：①通过苏木精-伊红（HE）染色和 组外，其余组大鼠腹腔注射小剂量观察肝组织病理，检测血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）；②通过实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RTqPCR）法检测肝组织促炎因子白介素-1β（IL-1β）、单核细胞趋化蛋白1（MCP1）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA
水平，同Western blot N-甲基转移酶（SUV39H2）、SIRT1、乙酰化核因子-κB p65（Acetyl-p65）、时采用 法检测肝组织组蛋白-赖氨酸 亚基p53（Acetyl-p53）、剪切型多聚ADP核糖多聚酶（Cleaved-PARP）及凋亡相关分子p53乙酰化肿瘤抑制蛋白 上调凋亡调节因子（PUMA）、Bcl-2相关蛋白（Bcl-xL）的蛋白表达水平。结果 ①HF组大鼠肝组织出现广泛肝细胞脂肪变性，HF-CCl4
组除此之外还出现大量肝细胞气球样变性、炎症细胞浸润和凋亡小体，DF
组大鼠肝组织脂肪变性、气球样变和炎症浸润程度均显著减CCl4 ALT、AST HF N、轻。小剂量 未导致肝组织异常改变。血清 水平在各组大鼠中的变化趋势同肝组织病理改变，在 组比N⁃CCl4组上调（P<0.05），在HF-CCl4 HF组增加（P<0.05），而在DF组上述转氨酶下调（P<0.05）。②肝组织SIRT1
组又较 水平在HF HF-CCl4 N组（P<0.05），DF SIRT1水平显著提高（P<0.05）；SUV39H2 SIRT1
组和 组大鼠低于 组 表达水平变化则与 趋势相反（P<0.05）。大鼠肝组织Acetyl-p65 IL⁃1β、MCP1 TNF⁃α mRNA HF HF-CCl4 N组升高（P<0.05），水平及促炎因子 及 在 组和 组较
DF HF-CCl4 调（P<0.05）。HF HF-CCl4 Acetyl-p53 PUMA、Cleaved-PARP N组而在 组的表达较 组下 组和 组大鼠肝组织 及 高于（P<0.05），而 Bcl-xL蛋白则相反（P<0.05）；与HF HF-CCl4组比较，DF Acetyl-p53、PUMA、Cleaved-PARP Bcl-xL组和 组逆转了 及
NAFLD SIRT1抑制核因子-κB蛋白表达。结论 当飞利肝宁胶囊可改善毒性物质诱导的 大鼠急性肝损伤，其机制可能与上调
（NF-κB）和p53
介导的炎症、凋亡信号通路有关。
【关键词】 非酒精性脂肪性肝病；肝损伤；当飞利肝宁胶囊；大鼠模型；作用机制；中药研究
rats were randomly divided into a normal（N）group，an NAFLD model（HF）group，a normal with CCl4（N-CCl4）group，an NAFLD with CCl4（HFCCl4）group，and a Dangfei Liganning Capsule（DF）group. Rats in the N and N-CCl4 groups were fed a normal standard diet，while those in the HF， HF-CCL4，and DF groups received a high-fat diet. Additionally，the DF group was simultaneously treated with Dangfei Liganning Capsules（0.3 g·kg-1） daily by gavage. After 8 weeks，except for the N and HF groups，the remaining rats received an intraperitoneal injection of a low dose of CCl4. Rat serum and liver tissues were collected 48 hours later. The parameters measured included：①Liver tissue pathology was observed through HE staining； Serum alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） levels were tested；②mRNA levels of pro-inflammatory cytokines interleukin-1β（IL-1β），monocyte chemoattractant protein 1（MCP1）and tumor necrosis factor- α（TNF- α）in liver tissues were detected by RTqPCR，while protein expression levels of suppressor of variegation 3-9 homolog 2（SUV39H2），SIRT1，acetylated p65（Acetyl-p65），acetylated p53 （Acetyl-p53），cleaved poly ADP-ribose polymerase （Cleaved-PARP），P53 up-regulated modulator of apoptosis （PUMA） and Bcl-2 associated protein（Bcl-xL）were measured by Western blot. ①Diffuse hepatic steatosis was observed in the HF group，while the HF-CCl4 group also
Results showed significant hepatocyte ballooning，inflammatory cell infiltration，and apoptotic bodies. The degree of steatosis，ballooning，and inflammatory infiltration in the DF group was significantly alleviated. Low-dose CCl4 did not cause abnormal pathological changes in liver tissues. The change trends in serum ALT and AST levels among the rats in each group corresponded with the histopathological change in liver tissues. The levels were upregulated in the HF group compared to those in the N and N-CCl4 groups（P<0.05），increased further in the HF-CCl4 group compared to those in the HF group （P<0.05），while in the DF group，the levels of these transaminases were downregulated（P<0.05）. ②The hepatic expression SIRT1 protein levels in rats of the HF and HF-CCl4 groups were lower than those in the N group（P<0.05），whereas the DF group showed a significant increase in SIRT1 levels（P<0.05）. The expression change trend of SUV39H2 was opposite to that of SIRT1（P<0.05）. The levels of Acetyl-p65 and mRNA levels of proinflammatory cytokines IL-1β，MCP1，and in rat liver tissues in the HF and HF-CCl4 groups were elevated compared to those in the N group
TNF-α
（P<0.05），but were downregulated in the DF group compared to those in the HF-CCl4 group（P<0.05）. The expression levels of Acetyl-p53，PUMA， Cleaved-PARP were higher in liver tissues of rats in the HF and HF-CCl4 groups than those in the N group（P<0.05），whereas the expression of BclxL protein exhibited the opposite trend（P<0.05）. Compared to the HF and HF-CCl4 groups，the DF group reversed the expression of Acetyl-p53， PUMA，Cleaved-PARP，and Bcl-xL proteins. Dangfei Liganning Capsules could improve acute liver injury induced by toxic substances
Conclusion in rats with NAFLD，potentially through upregulating SIRT1 to inhibit the NF-κB and p53 mediated inflammation and apoptosis signaling pathways. Keywords：non-alcoholic fatty liver disease；liver injury；Dangfei Liganning Capsules；rat model；mechanism of action；traditional Chinese herbal medicine research non-alcoholic fatty liver非酒精性脂肪性肝病（ disease，NAFLD）是在排除饮酒及其他明确诱因外以脂质大量沉积于肝脏为主的临床病理综合征，包括单纯non-alcoholic性 脂 肪 肝 、非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 炎（ steatohepatitis，NASH
）、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌［ 1］。随着肥胖、糖尿病患病率不断上升，NAFLD
已成为主要NAFLD慢性肝病。系统评价［2-3］显示，2009年～2019年30%，其中在
全球总患病率超过 2016年～2019年期间38%，但迄今仍然缺乏明确有效的临床治疗药物。达到
NAFLD
发病机制复杂，遗传、表观遗传和环境因素的相互作用以及不同器官和组织相互影响均可影响其发生NAFLD
发展［4-5］。 可显著增加毒性物质对肝损伤的敏NAFLD感性，同等剂量的毒性物质可诱导 大鼠较正常大鼠出现更严重的急性肝损伤［6-7］，而对正常鼠肝脏无影响的小剂量四氯化碳（CCl NAFLD
）可加剧 大鼠肝功
4
NAFLD
8 9
能障碍［ ］。临床研究［ ］也表明， 患者对药物性肝损伤更敏感，被认为是药物性肝炎的独立危险因素。因此，NAFLD
患者更需要采取措施及时防治肝损伤。炎症浸润和细胞凋亡是导致肝损伤的重要因素，核因子-κB（NF-κB）以及肿瘤抑制蛋白p53
信号通路的1（SIRT1）是调控与此密切相关［10］。沉默信息调节因子
NAD
+依赖性组蛋白脱乙酰酶，属于沉默信息调节因子
2
（Sir2）家族。多项研究［11］显示，SIRT1 NAFLD
下调在 进展中发挥重要作用。除外对脂质代谢的调控，SIRT1可
NF-κB p65 p53
使 亚基 以及促凋亡分子 去乙酰化而失活，从而抑制炎症介质和细胞凋亡相关分子的表达［12-13］。当飞利肝宁胶囊是包含当药和水飞蓟提取物的中成药，可改善病毒性肝炎患者肝功能并减轻肝脏
NAFLD
炎症和纤维化［14］，减轻 患者肝脂肪变性［15］，同时能对抗肝毒性药物诱发的肝损伤［16 ］。动物实验研究［17-18］发现，当飞利肝宁胶囊可通过调控脂肪酸合成改
NAFLD NAFLD
善 小鼠脂肪变性程度，并可减轻 大鼠对毒性物质的肝损伤敏感性。在此基础上，本研究拟基
SIRT1 NF-κB p53
于 调控 及 信号通路研究当飞利肝宁
CCl4 NAFLD
胶囊对 诱导 大鼠急性肝损伤的保护作用
NAFLD
机制，以期为其治疗 提供依据和指导。
1 材料与方法
1.1
材料
1.1.1 SPF Wistar
实验动物 级雄性 大鼠30只，体质量（170±10）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。动物使用合格证号：20170005014667。实验大鼠饲养于上海中医药大学附属龙华医院实验动物中心，温度（24±2）℃，湿度（55±10）%，12 h/12 h的光照/黑暗周期。实验期间大
鼠自由摄食和饮水。本实验方案由上海中医药大学附属龙华医院实验动物伦理委员会批准（批准号： LHERAW-19001）。
1.1.2
药物与试剂 当飞利肝宁胶囊，四川美大康药业有限公司（批号：180807）。根据《中药药理学研究方法学》19 中人与大鼠等效用药剂量公式计算，大鼠每单［ ］
0.3 g·kg-1。位体质量用药量是成人用药量的7倍，为CCl4，国药化学试剂有限公司（纯度≥99.5%，批号： 20181011）；RNA TRIzol、PCR Power抽提试剂 试剂
SYBR® Green PCR Master Mix，美国 Life Technologies
公1957772、1906798）；GoScriptTM司（批号分别为 逆转录试Promega
剂盒，美国 公司（批号：123665）。
Western blot SIRT1所需一抗均为兔源性。 抗体， Abcam公司（批号：GR3200692-2）；组蛋白-赖氨酸英国
N- SUV39H2）、p53
甲基转移酶（ 上调凋亡调节因子（PUMA）抗体，武汉三鹰生物技术有限公司（批号分别κB p65为 00003404、00048845 ）；乙酰化核因子- 亚基（Acetyl-p65 ADP Cleaved）、剪切型多聚 核糖多聚酶（ PARP）、Bcl-2相关蛋白（Bcl-2 associated protein，Bcl-xL） CST
抗体，美国 公司（批号分别为1、8、6）；乙酰化肿瘤p53（Acetyl-p53）抗体，美国 Abbkine
抑制蛋白 公司（批号：ATRSE2101）；β-肌动蛋白（β-actin），杭州华安生物技术有限公司（批号：R1207-1）；ECL
化学发光底物，美Merk Millipore
国 公司（批号：2032502）。
高脂饲料（88%普通饲料+10%猪油+2%
胆固醇），上海斯莱克实验动物有限责任公司。
1.1.3 Sartorius
主要仪器 电子天平，德国 公司（型号： CPA3235 Eppendorf ）；高速冷冻离心机，德国 公司（型号：5417R Roche ）；全自动生化分析仪，瑞士 公司（型号：Modular DP）；自动脱水浸蜡仪、石蜡包埋仪、石蜡切Leica TP1020、EG1150H、片机，德国 公司（型号分别为
RM2235 Nikon ）；正置显微镜，日本 株式会社（型号： ECLIPSE 50i）；微孔板检测仪，美国BioTek
公司（型号： Synergy H4 Thermo Fisher ）；超微量分光光度计，美国
Scientific NanoDrop2000
公司（型号： ）；实时荧光定量PCR ABI公司（型号：StepOne Plus）；垂直电泳仪，美国
槽、Trans-blot Bio-Rad转印槽、基础电泳仪，美国 公司Mini、Mini、PowerPac）；凝
（型号分别为 胶成像系统，英Syngene Syngene G：Box Chemi XT4）。国 公司（型号为
1.2
动物分组 大鼠适应性喂养1周，按体质量随机组，即正常（N）组、NAFLD模型（HF）组、正常加分为5
CCl （N-CCl ）组、NAFLD CCl HF-CCl4
加 （4 ）组和当飞利
4 4
肝宁胶囊（DF）组。
1.3 N N-CCl4
造模与干预组和 组大鼠喂食普通饲科，HF HF-CCl4 DF组给予高脂饲料，DF
组和 及 组每日mL·kg ·d-1，其余组灌胃等体积质同时给予药物灌胃8
-1 0.9% N HF量分数为 的氯化钠溶液。8周后，除 组和 组CCl 33% CCl（ CCl外，其余组大鼠腹腔注射小剂量 ［ 4∶ 4 4玉米油=1∶2）0.5 mL·kg
-1 ［18］ ］。剂量已经前期实验 摸索， h 2%对正常大鼠无肝损伤。48 后大鼠经 戊巴比妥钠mg·kg
（30 ）麻醉，腹主动脉取血，并收集肝组织样本。
-1
1.4
检测指标与方法
1.4.1 ℃的大鼠血血清生化分析 取分装冻存于-80清，应用全自动生化分析仪分别检测丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）的血清水平。
1.4.2 4%肝组织病理情况 将大鼠肝组织置于 中性μm甲醛溶液固定，进行常规脱水、石蜡包埋，制备4 组织切片，用苏木精-伊红（HE）染色液按照常规流程进行染色，镜下观察大鼠肝组织病理学改变。
1.4.3 mRNA
促炎因子 表达 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）法检测肝组织促炎因子mRNA TRIzol水平。取大鼠肝组织加 匀浆，依次加入氯RNA。用 GoScriptTM仿、异丙醇分离提取 逆转录试剂盒RNA cDNA，反应条件为 ℃、15 min，85 ℃、将 转化为 37 s。加入PCR Master Mix PCR
5 进行荧光定量 ，检测各组肝组织样本中白介素-1β（IL-1β）、单核细胞趋化蛋白
1 （MCP1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA
水平。引物由上海闪晶分子生物科技有限公司合成，引物序列1。PCR ℃预处理 min；95 ℃预变性见表 反应条件：50 2 min；95 ℃变性 s，60 ℃退火 s，72 ℃延伸 s，持
2 15 15 60
续40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt方法计算目mRNA
的基因 相对表达水平。注：TNF-α -α基因，MCP1
为肿瘤坏死因子 为单核细胞趋化蛋白1基因，IL-1β为白介素-1β基因，β-actin β-肌动蛋白基因。
为
1.4.4 Western blot肝组织相关蛋白表达水平 采用 法检测肝组织相关蛋白表达水平。大鼠肝组织加入放射性免疫沉淀测定缓冲液（RIPA）匀浆，离心提取蛋白，应用二辛可宁酸（BCA）法测定浓度，95 ℃变性后，于10% mA聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，然后200 恒流1.5 h转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用5%
脱脂奶粉室h ；一抗（抗体稀释度：β-actin 000；SIRT1温封闭1 为1∶2为1∶500；SUV39H2、Acetyl-p65、Acetyl-p53、Cleaved
PARP、PUMA、Bcl-xL抗体均为1∶1 000）4 ℃孵育过夜；
磷酸盐吐温缓冲液（ PBST ）洗后用二抗（ 1∶1 000）室温h；PBST ECL
孵育1 洗膜后加 发光液，应用多功能发光β⁃actin成像系统采集图像并分析蛋白灰度值，以 为内参计算蛋白相对表达量。
1.5 SPSS 24.0统计学方法 实验数据采用 软件进行GraphPad Prism 8.0
统计学分析，用 作图。计量资料以xˉ± s表示。采用单因素方差分析，两组间比较采用Dunnett's post-hoc P<0.05
分析。以 为差异有统计学
意义。2 结果2.1
对大鼠肝组织形态及血清转氨酶的影响大鼠肝HE N组比较，N-CCl4
组织 染色显示：与 组大鼠肝组织2.2 SIRT1、SUV39H2
对大鼠肝组织 蛋白表达的影
N SIRT1 HF
响 与 组比较，大鼠肝组织 蛋白水平在 组、HF-CCl4 降（P<0.05），而 N-CCl4
组明显下 在 组差异无统计学意义（P>0.05）；与HF-CCl4组比较，DF组大鼠肝组SIRT1表达水平明显上升（P<0.05）。见图2A。
织 N SUV39H2 HF
与 组比较，大鼠肝组织 蛋白水平在HF-CCl4 调（P<0.05），N-CCl4和 组均明显上 组无明显变
化（P>0.05）；与 HF-CCl4 DF
组比较， 组大鼠肝组织未发现明显异常；HF组在中央静脉周围可见大面积肝细胞脂肪变性；HF-CCl4组除肝细胞脂肪变性外可见大量气球样变性，并有炎症细胞浸润及凋亡小体形成。DF HF-CCl4
组相较于 组肝细胞脂肪变性程度明显改1A。善，未观察到明显炎症浸润及气球样变。见图
N大鼠血清转氨酶水平：与 组比较，高脂饮食诱导HF HF-CCl4 ALT、AST
的 组和 组大鼠血清 水平显著升高（P<0.05），且 HF-CCl4 HF ALT、AST组较 组血清中 水平明显升高（P<0.05）。与HF-CCl4组比较，DF
组大鼠可
ALT、AST水平（P<0.05）。这些结果提示，小
显著降低
CCl4
剂量腹腔注射 对正常大鼠不引起肝功能损害，但HF-CCl4 NAFLD可显著加剧高脂饲养的 组的 大鼠肝损DF伤，当飞利肝宁胶囊的干预可显著减轻 组大鼠的肝1B。
损伤程度。见图SUV39H2蛋白表达水平明显下降（P<0.05）。见图2B。2.3 对大鼠肝组织Acetyl-p65及促炎因子表达水平的影响 图3A显示了大鼠肝组织Acetyl-p65蛋白表达水平：与N组比较，HF、HF-CCl4组大鼠肝组织Acetyl-p65蛋白水平均显著升高（P<0.05），其中HF-CCl4组更为明N-CCl4 N显，而 组与 组比较差异无统计学意义（ P> 0.05）；与 HF-CCl4组比较，DF Acetyl-p65组大鼠肝组织蛋白水平显著下降（P<0.05）。
3B N组比较，HF组、HF-CCl4图 结果显示：与 组大mRNA IL-1β、MCP1 TNF- α鼠肝组织中 和 水平均显著升高（P<0.05 HF-CCl4 N-CCl4
），其中 组更为明显，而 组
2.4 Acetyl-p53对大鼠肝组织 及凋亡相关分子水平的N HF HF-CCl4
影响 与 组比较， 组及 组大鼠肝组织
Acetyl-p53蛋白水平显著升高（P<0.05），而N-CCl4
组大鼠Acetyl-p53蛋白水平差异无统计学意义（P>0.05）；肝组织N mRNA水平升高（P<0.05）。与HF与 组比较仅IL-1β CCl4 DF IL-1β、MCP1 TNF-α组比较， 组大鼠肝组织 和mRNA水平均显著下降（P<0.05）。与HF-CCl4组比较，DF组大鼠肝组织Acetyl-p53蛋白水平显著降低（P<0.05）。见图4A。N组比较，HF HF-CCl4与 组及 组大鼠肝组织细胞Cleaved-PARP PUMA凋亡过程标志物 、促凋亡分子 蛋
白水平显著升高（P<0.05）；与HF-CCl4组比较，DF
组大Cleaved-PARP、促凋亡鼠肝组织细胞凋亡过程标志物
PUMA蛋白水平显著降低（P<0.05）。与N
分子 组比较， HF HF-CCl4 Bcl-xL
及 组大鼠肝组织抗凋亡分子 蛋白水P<0.05），HF-CCl4平显著下降（ 组肝组织抗凋亡分子
3 讨论
HE本研究通过大鼠肝组织 染色及大鼠血清转氨CCl4
酶检测显示：小剂量 对正常大鼠无明显肝脏毒性；高脂饲料8周可诱导大鼠单纯性肝细胞脂肪变性的NAFLD
模型，在此基础上联合腹腔一次性注射小剂量CCl4
可诱导急性严重肝损伤。这与既往实验结果一NAFLD
致，证实 大鼠对毒性物质诱导的肝损伤更为敏感［18］。当飞利肝宁胶囊的主要功效为清热解毒、利湿退黄，临床上被广泛用于治疗湿热蕴结型肝系疾病，具有较好的保肝作用［20］。研究［21］显示其可通过上调锌指
Bcl-xL HF-CCl4组比较，DF蛋白水平下降更明显；与 组Bcl-xL P<
肝组织抗凋亡分子 蛋白水平显著上升（ 0.05）。N N-CCl4 Cleaved PARP、组与 组之间，肝组织PUMA Bcl-xL蛋白水平差异无统计学意义（P>0.05）。及4B。
见图A20 NF-κB D-氨基半乳糖诱蛋白 抑制 激活而有效阻止导的小鼠急性肝损伤。此外，该药物还可抑制炎性小体形成，减轻脂肪肝大鼠炎症浸润［8］。与这些研究结果一致，本研究结果显示，应用当飞利肝宁胶囊干预可显CCl4 NAFLD
著减轻 诱导的 大鼠急性肝损伤，包括改善肝细胞气球样变性、炎症浸润及细胞凋亡等肝组织病理变化，下调血清转氨酶水平，减轻细胞凋亡水平。当飞利肝宁胶囊主要由水飞蓟和当药的提取物组成，其CCl4 D-氨基半乳糖下诱导的小主要成分水飞蓟宾对 或鼠肝损伤具有显著的改善作用［22］。龙胆苦苷是当药的NAFLD 23主要活性成分，具有保肝利胆作用［ ］，可减轻
子