Prodigios de la era C R I S PR
Considerado uno de los avances clave del siglo XXI, el cortapega genético, que los expertos conocen como tecnología CRISPR, es una herramienta que ya ha alcanzado la edad de madurez, aunque todavía se está explorando su inmenso potencial. Aquí te contamos su historia, sus fabulosos logros y cómo se intentan limar sus defectos para que permita editar ADN casi a voluntad de forma sencilla, precisa, económica y sin sobrepasar los límites de la ética.
Todo empezó en el congelador de un laboratorio anónimo perteneciente a la Universidad de Alicante. Corría el caluroso verano de 1993 cuando el microbiólogo Francisco Juan Martínez Mojica analizaba con paciencia el material genético de la arquea Haloferax mediterranei, un microorganismo unicelular recogido “Dios sabe cuándo” –según sus palabras– en las salinas alicantinas de Santa Pola.
Rápidamente se dio cuenta de que aquellas muestras congeladas tenían unas características muy peculiares. En el genoma de la arquea aparecían a intervalos regulares secuencias repetidas de nucleótidos, los ladrillos moleculares que forman el ADN y el ARN.
ERAN BUENOS TIEMPOS PARA QUIENES SE DEDICABAN A ESTUDIAR LAS PECULIARIDADES DE LOS GENOMAS. Apenas dos años después de que Mojica descubriera esos inexplicables patrones, se obtuvo el primer libro de instrucciones genético completo de un organismo. Y, en los años posteriores, se fueron acumulando secuenciaciones tanto de bacterias como de arqueas, ambos microbios sin núcleo pero con características diferenciadas.
Gracias al nuevo aluvión de información, Mojica pudo investigar si las reiteraciones que había encontrado en la Haloferax mediterranei –un microbio halófilo, es
decir, que prolifera en ambientes muy salinos– también las presentaban otras especies. Y, para gran sorpresa suya, no tardó en ratificarlo.
Las desde entonces bautizadas como repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas –o CRISPR, por sus siglas en inglés– y las secuencias de espaciadores –la información genética encontrada en los espacios que median entre dichas reiteraciones– empezaron a servir como herramientas para identificar cepas de bacterias, un proceso conocido como espoligotipado. Pero a Mojica no le bastaba con esto. “Intuí que debían cumplir una función importante, porque muchas células morían cuando las manipulábamos”, ha comentado al periódico El Confidencial.
En búsqueda de respuestas, volvió a las bases de datos. Fue un trabajo de años que acabó dando sus frutos. “Por fin encontramos una secuencia espaciadora en una cepa de la bacteria Escherichia coli idéntica a la de una secuencia de un virus bacteriófago que infecta a
distintas cepas de dicho microbio. Para comprobar que no era algo fortuito, localicé e hice comparaciones de los espaciadores presentes en los genomas de todos los procariotas [microorganismos sin núcleo] donde fuimos capaces de detectar regiones CRISPR... Et voilà, encontramos otras coincidencias”.
Ocurrió en 2003, una década después de haber descubierto las secuencias de CRISPR. Finalmente, Mojica cayó en la cuenta de lo que estaba viendo: cuando las bacterias poseían secuencias espaciadoras idénticas a fragmentos del genoma de determinados virus, estos agentes patógenos no aparecían en los microbios. O sea, se habían vuelto inmunes a su infección. Mojica acababa de descubrir un sistema defensivo primitivo, adaptativo y, además, hecho de base genética; una especie de autovacuna que protege a las bacterias frente a los ataques víricos. Y a diferencia de nuestro sistema inmune, que debe ser educado para brindar una protección efectiva, es heredable.
SIN EMBARGO, COMO SUELE PASAR CUANDO HABLAMOS DE CAMBIOS DRÁSTICOS DE PARADIGMA, EL MICROBIÓLOGO ALICANTINO sufrió lo suyo para ver sus hallazgos publicados. Las revistas de mayor impacto rechazaron el manuscrito hasta que, en 2005, la menos conocida Journal of Molecular Evolution aceptó difundir el artículo, después de un largo proceso de revisión. Dos años después, científicos de una empresa productora de yogures danesa llamada Danisco proporcionaron la confirmación empírica de que sus conclusiones eran correctas. Como resume magistralmente Lluís Montoliu, investigador del CSIC, en su libro Editando genes: recorta, pega y colorea, “los sistemas CRISPR están formados por largas filas de secuencias repetitivas, intercaladas por espaciadores que representan fragmentos de genomas de virus o de plásmidos [pequeña molécula de ADN circular] que han atacado anteriormente el microorganismo. Esas secuencias y espaciadores se transcriben, esto es, se copian y se convierten en moléculas de ARN, que permanecen dentro de la bacteria a la espera de encontrar la secuencia de ADN homóloga con la cual aparearse.
CUANDO EL MISMO VIRUS INFECTA OTRA VEZ A LA BACTERIA, esta reconoce de inmediato la nueva infección, al aparearse la pequeña molécula de ARN con su correspondiente secuencia complementaria del virus invasor. La unión tiene lugar gracias a una proteína, la Cas –acrónimo del inglés CRISPR associated protein–, que es capaz de presentar el ARN a su ADN complementario. Al completarse el apareamiento, el microbio interpreta que el mismo virus quiere volver a entrar. Entonces, la proteína Cas activa su cometido de endonucleasa, una enzima que corta el ADN internamente en posiciones muy precisas. Estas secciones en la doble cadena del ADN viral provocan su degradación y descomposición”.
A lo mejor te estás preguntando: ¿pero cómo me afecta a mí? No fue hasta el verano del 2012 que esta información recorrió el tortuoso camino que conduce de la investigación básica a la aplicada. Desde las páginas de la
La edición genética existe desde los años 70, pero hasta la aparición de la nueva técnica los resultados eran decepcionantes
revista Science, un artículo que quedará para siempre en los anales de la historia de la ciencia informó a la comunidad científica del increíble potencial que tenía ese mecanismo de corte selectivo de ADN.
Firmado por las investigadoras Jennifer Doudna, bióloga molecular de la Universidad de California en Berkeley (EE. UU.), y Emmanuelle Charpentier, actual directora del Instituto Max Planck de Biología Infecciosa en Berlín (Alemania), el artículo proponía por primera vez el uso de los componentes del sistema CRISPR –en este caso, procedente de la bacteria Streptococcus pyogenes– como herramienta para la edición genética. Es lo que más tarde se vino a llamar cortapega genético o tijeras moleculares.
EL DESEO DE MANIPULAR Y MODIFICAR EL GENOMA NOS ACOMPAÑA desde que existen los estudios sobre genética. A partir de los años 70, los científicos activan y desactivan genes de manera experimental, pero, a pesar de las promesas terapéuticas que han acompañado siempre los descubrimientos en este campo, el historial de éxitos era decepcionante... Hasta que llegó CRISPR/ Cas9, como se conoce al sistema presentado por Doudna y Charpentier.
Esta técnica, la cuarta en una serie de métodos basados en la acción de las enzimas nucleasas, constituyó un verdadero salto cualitativo. Mientras que para traba
jar con las TALEN, las herramientas predecesoras, se necesitaba casi un centenar de reactivos –compuestos químicos que producen reacciones–, para las CRISPR basta con dos. Experimentos que llegaban a costar 5.000 euros –con pobres resultados, además– se pueden ahora llevar a cabo por menos de sesenta euros. Por añadidura, la técnica de cortapega permite manipular con facilidad cualquier región del genoma e incluso varias zonas a la vez.
HOY EN DÍA, SI TECLEAMOS ‘CRISPR’ EN UN BUSCADOR DE INTERNET aparecerán más de cien millones de resultados. “Supera a Leo Messi –65,3 millones de entradas– y Cristiano Ronaldo –74 millones–”, reconoce con asombro en su libro Montoliu. Según el informe Global CRISPR/Cas9 Market Outlook 2022, se estima que el mercado global relacionado con la nueva tecnología superará dentro de tres años los 1.500 millones de dólares.
Miles de artículos científicos se han publicado al respecto y, como defiende Montoliu en sus conferencias, “el límite de las aplicaciones está en la imaginación de los investigadores”. El experto recuerda, por ejemplo, un espectacular experimento que desarrolló el equipo de George Church, de la Universidad de Harvard (EE. UU.), en 2017. Church codificó los datos de cuatro imágenes estáticas y cinco fotogramas de una película en el material genético de una bacteria, y asignó cuatro tonalidades de gris a cada una de las letras que componen el código genético: adenina (A), citosina (C), timina (T) y guanina (G). Una vez almacenadas en el ADN microbiano, las imágenes pueden ser recuperadas mediante una simple secuenciación del genoma.
En resumen: con la CRISPR/Cas9 es posible inactivar, modificar o eliminar un gen o corregir una mutación gracias a que las proteínas Cas realizan cortes en la doble cadena de ADN con una precisión nunca antes vista. Pero hay un problema: las roturas en las hebras de ADN son, para las células, acontecimientos traumáticos, que pocas veces pueden repararse sin dar origen a daños permanentes. No hay que olvidar que, en origen, el mecanismo CRISPR está diseñado para aniquilar agentes patógenos sin contemplaciones.
Aunque todas las células están equipadas con sistemas para restaurar la integridad del material genético afectado por una agresión, sus habilidades no son tan eficaces como nos gustaría, y muchas veces dan origen a mutaciones. Esto está muy bien si nuestro objetivo es inactivar un gen –o destruir a un agresor, como quieren las bacterias–, mientras que si lo que deseamos es jugar a nuestro antojo con el genoma, la cosa se complica. Para atajar esta limitación, los científicos añaden al ARN guía otra secuencia cuyas puntas se corresponden con las que se originarían tras el corte. Así, el añadido sirve de molde para la reparación de la doble cadena de ADN y hay más posibilidades de que los científicos integren la nueva información en la célula.
La pega es que la ruta alternativa de reparación resulta bastante más difícil de activar que la normal, o sea, la introducción y
Si tecleamos en un buscador de internet ‘CRISPR’, aparecerán más resultados que si lo hacemos con ‘Ronaldo’ o ‘Messi’
eliminación de nucleótidos a lo loco hasta dar con una combinación capaz de cerrar la fractura en la molécula de ADN. Este método, aunque eficaz, es cualquier cosa menos preciso, y además carece de memoria: aunque haya una fractura similar en distintas células, la información no se comparte. Como consecuencia, la reparación se hace de forma distinta en cada uno de los casos. Este hecho da origen, por ejemplo, a los denominados ratones mosaico, con células cuyos genomas presentan diferencias debidas a las variopintas soluciones ejecutadas por los mecanismos de reparación.
LA LISTA DE CONTRAINDICACIONES NO ACABA AQUÍ. La CRISPR/Cas9 también cuenta con defectos propios –no achacables a los mecanismos de cicatrización celular– que provocan lo que se conoce como mutaciones offtarget, traducible como ‘fuera de la diana’. Aunque la enzima endonucleasa Cas9 corta preferentemente en los sitios donde encajan al cien por cien la guía de ARN y el gen que se quiere editar, existen en el genoma otras secuencias cuyas diferencias con relación a dicha guía son mínimas y que, muchas veces, también acaban sufriendo un bocado. Para superar el problema, los científicos juegan con la cantidad de intervenciones y el tiempo dedicado a ellas. Si limitan ambos factores a la hora de actuar, se puede afinar la precisión y disminuir la probabilidad de que existan mutaciones off-target.
Todos estos obstáculos no impiden que
las CRISPR sean revolucionarias y hayan permitido, por ejemplo, crear con rapidez ratones editados genéticamente. Si antes se tardaba entre doce y dieciocho meses en desarrollar un único ejemplar mutante, el laboratorio de Rudolf Jaenisch, en el Instituto Whitehead para la Investigación Biomédica (EE. UU.), redujo ese plazo a entre cuatro y seis meses gracias a CRISPR. Y, además, lograron introducir varias mutaciones simultáneamente.
Como cuenta en su libro Montoliu, “hoy en día, mutar un gen de ratón se ha convertido en una técnica trivial, rutinaria, al alcance de cualquier laboratorio mínimamente equipado con técnicas de biología y embriología molecular [...]. Todo lo que ha venido después ha sido un torrente de información; miles de publicaciones que refieren el éxito de las herramientas CRISPR para editar genomas de prácticamente cualquier organismo imaginable”.
¿Y QUÉ PASA CON LOS HUMANOS? AQUÍ ENTRAMOS EN TERRENO PANTANOSO. Comparado con las herramientas anteriores, el sistema CRISPR/Cas9 ha logrado aumentar el porcentaje de moléculas de ADN reparadas correctamente de un 5 % a un 30 %, pero un riesgo del 70 % sigue siendo inaceptable. No parece suficiente obstáculo. Según explica Montoliu, “desde el momento en que las tecnologías CRISPR se convirtieron en realidad, la posibilidad de editar el genoma en embriones humanos y, con ello, influir sobre su desarrollo y características finales, era demasiado tentadora”. Que ocurriera era cuestión de tiempo.
Y así fue. El 18 de abril de 2015, científicos chinos publicaron, en la revista Protein Cell, el primer estudio que documentaba ese tipo de intervención. Los biólogos utilizaron sobrantes de protocolos de reproducción asistida que, además, eran triplonucleares, es decir, resultaban de la fecundación de un óvulo por dos espermatozoides. Se trataba de embriones inviables que nunca podrían dar origen a una persona.
Después de eso, solo hubo que esperar a que estallara la bomba. A finales de 2018, el científico también chino He Jiankui desveló que había utilizado CRISPR para editar embriones humanos que, posteriormente, había implantado en una mujer. De esa gestación habían nacido dos gemelas; el escándalo fue mayúsculo.
HOY EN DÍA, QUEDA MUCHO POR EXPLICAR. Jiankui habló de sus experimentos a través de vídeos en su propio canal de YouTube y en una presentación en la Segunda Cumbre Internacional de Edición Genética Humana, y luego no se supo más de él. Sus resultados no se han publicado y, hasta la fecha, nadie ha podido evaluar si realmente hizo lo que dice haber hecho. El Gobierno del país asiático afirma estar investigando el caso.
Según las explicaciones de Jiankui, su objetivo fue inactivar el gen CCR5, que dirige la síntesis de la proteína que actúa como puerta de entrada del virus del sida (VIH) en los linfocitos, ya que el padre de las gemelas era seropositivo. No sabemos si lo logró, ni si generó otras alteraciones genéticas indeseadas en los bebés, pero la co
Un biólogo ruso ha anunciado recientemente que pretende desactivar en un embrión humano un gen vinculado a la sordera
quienes, por ahora, no tienen esperanza de cura.
La mejora de la eficacia y la seguridad de estos tratamientos debe ser, por tanto, la prioridad. Con cada vez más científicos dedicados a la búsqueda de nuevos sistemas CRISPR –usando proteínas que no impongan las limitaciones de Cas9–, o a tunear al sistema que ya conocemos, seguro que más pronto que tarde veremos grandes avances.
De todas las propuestas existentes hasta la fecha, las más promisoras han salido del mismo lugar: el Instituto Broad, un centro mixto de la Universidad de Harvard y el MIT. La primera, conocida como base editing –‘edición de bases’–, se parece a una “cirugía química de precisión”, según declaró el director de la investigación, David Liu, a Nature. Permite, al usar una proteína Cas9 desactivada, sustituir letras aisladas del código genético sin cortar la doble hélice de ADN. Esto supone una ventaja enorme, ya que no se encienden los mecanismos de reparación de la célula, lo que disminuye notablemente los errores.
POR AQUEL ENTONCES, NATURE AUGURABA QUE “LA CAPACIDAD DE ALTERAR BASES ÚNICAS significa que los investigadores pueden ahora intentar corregir más de la mitad de todas las enfermedades genéticas humanas”. Las ilusiones se vinieron abajo cuando fue verificado que estos editores también causan numerosas mutaciones off-target.
Más recientemente, el pasado día 21 de octubre, el mismo grupo de expertos presentó la tecnología prime editing –‘edición de calidad’–, que promete, según sus autores, la posibilidad de reparar el 89% de las 75.000 variantes genéticas humanas asociadas a enfermedades heredables.
El prime editing hace uso de una proteína Cas9 especial, alterada en laboratorio, capaz de seccionar una sola de las cadenas de la doble hélice de ADN. Con este cortapega prémium, el equipo liderado por Liu realizó 175 experimentos en células humanas, y logró corregir las causas genéticas de trastornos tan distintos como la fibrosis quística, la anemia falciforme y la enfermedad de Tay-Sachs. “Si CRISPR/ Cas9 funciona como unas tijeras moleculares y los editores de base como lápices, entonces podemos pensar en los editores de calidad como procesadores de texto”, explicó Liu en una rueda de prensa.
Mientras que la CRISPR se basa en una
Muchos científicos buscan nuevos sistemas CRISPR o perfeccionar el ya existente
enzima capaz de cortar el ADN y un trozo de ARN guía que define el sitio donde intervenir, esta nueva tecnología funciona de un modo más complejo. Combina la actividad de corte de la Cas9 con otra proteína, llamada transcriptasa inversa, que convierte el ARN en ADN. Además, la guía de ARN también es ligeramente distinta, ya que además de incluir la información necesaria para el corte, contiene las instrucciones para realizar la propia edición genética.
CUANDO ENCUENTRA EL SITIO DONDE DEBE SECCIONAR, LA ENZIMA DE ESTE SISTEMA actúa solo sobre una de las cadenas de ADN. En ese hueco, la transcriptasa inversa va a añadir, letra por letra, la edición deseada. Terminado este proceso, la maquinaria celular retira la secuencia original, y la edición pasa entonces a integrar el material genético, lo que evitaría muchas de las mutaciones que se detectan cuando se usa CRISPR/Cas9. Por ahora, el mayor problema es el tamaño: la maquinaria molecular necesaria resulta bastante más voluminosa y compleja que la involucrada en CRISPR/Cas9, y, por eso, más difícil de hacer llegar hasta el interior de las células.
“Se necesita mucha más investigación en una amplia variedad de tipos celulares y organismos para entender mejor el prime editing y perfeccionarlo”, reconoció el equipo de Liu en la publicación de su trabajo en la citada revista Nature. Montoliu, en declaraciones al periódico El País, se ha mostrado también bastante cauteloso, explicando que otros grupos de científicos deben ahora poner a prueba la nueva herramienta. Solo eso “nos dirá si este procedimiento innovador para editar genomas va a tener posibilidades y recorrido terapéutico o si se va a quedar como una más de las decenas de propuestas con variantes alternativas de CRISPR que conocemos cada semana”, apuntaba el experto. El tiempo lo dirá...