MÜKEMMEL BİR YUMURTA PİŞİRDİĞİNİZİ BİLİMSEL BİR CİHAZLA NASIL ANLARSINIZ?

Dr. Özge KAYA | TERRA Analiz ve Ölçüm Cihazları Tic. A.Ş.

Günlük hayatımızda sıklıkla tükettiğimiz temel besin maddelerinden biri olan yumurtaya bir de bilimsel bir gözle bakmak ister misiniz? Cevabınız evet ise, Nanotemper Technologies firmasından aplikasyon uzmanı Mariano Cardenas’ın blogunda anlattıklarını sizinle paylaşmak istiyorum.

Yemek pişirmeyi seven Cardenas, HarvardX’in düzenlemiş olduğu “Bilim ve Aşçılık” isimli çevrimiçi kursta öğrendiklerini profesyonel iş hayatı ile harmanlayıp farklı denemeler yapmakta ve bu deneyimlerini bir blog üzerinden okuyucularına aktarmaktadır. HarvardX, kar amacı gütmeyen bir çevrimiçi öğrenme platformudur.

Bu derslerden birinde yumurtadaki proteinlerin farklı sıcaklıklarda nasıl denatüre olduklarını başka bir deyişle proteinlerin moleküler yapılarındaki değişiklikleri incelemiştir. “Protein denatürasyonunu gözünüzde canlandırmak için ramen eriştelerini düşünün. Yumak halinde gelirler ve onları sıcak suya koyduğunuzda açılmaya başlarlar. Aynı şey, proteinler ısıya maruz kaldığında da olur” diyor Cardenas. Yumurtadaki protein denatürasyonunu mercek altına koyarak proteinlerin gerçekten değiştiğini kendi gözleriyle görmek isteyen yazar bu iş için Tycho’yu kullanmıştır.

YUMURTALAR NEDEN ÇOK ILGINÇTIR?

Tycho deneyine geçmeden önce, yumurtaların yapısına biraz yakından bakalım. Yumurta kompleks bir biyolojik yapıdır. Tavuk yumurtası farklı şekillerde tüketilebilen ve en besleyici besinlerden biri olarak değerlendirilir. Yumurtalar protein, yağ, vitamin ve mineralce zengindirler. Renk, tat, köpürme ve emülsifiye etme özelliklerinden dolayı tatlıdan, tuzluya, çorbadan, kızartmaya birçok tarifte yer alır. Ortalama bir yumurta yaklaşık 57 gram ağırlığındadır ve bunun yaklaşık %10’u kabuk, %60’ı yumurta akı (su miktarına göre yoğunluğu değişen) ve %30’u yumurta sarısından oluşur.

MÜKEMMEL BIR YUMURTA IÇIN SICAKLIK DERECESI

Yumurtalar maruz kaldıkları sıcaklığa karşı yapılarında meydana gelen değişikliklerle adeta bir termometre gibi davranırlar. 5770 oC aralığında, çiğ yumurtadan tamamen pişmiş bir yumurtaya dönüşmelerini izleyebiliriz. Poşe, Benedict, haşlanmış veya diğer kıvamlardaki pişirme yöntemleri yumurta farklı sıcaklık değerlerine ulaştığında ortaya çıkar, böylece belirli bir protein grubu denatüre olmuş olur.

Farklı sıcaklık noktalarını tek tek ele alalım. 57 oC’de yumurta tamamen çiğdir, ancak pastörize edilmiştir. Bu sıvı kıvamdaki yumurtayı beze, mayonez veya pastörize yumurta kullanan diğer tariflerde kullanımı güvenlidir. 60 oC’de, poşe yumurta gibi çok az derecede pişmiştir. 62,7 oC’de tam bir Egg Benedict yumurta elde edersiniz. Beyazın rengi değişmiş ve katılaşmıştır ama sarısı hala kremamsı ve yumuşaktır. 65 oC’de, pişmiş bir yumurta sarısına sahip olursunuz, ancak yine de son derece yumuşak ve kremamsı olur, kızarmış ekmek için idealdir. 68 oC’de, yumurta sarısı yumuşaktır ve şekillendirilebilir ve 71 oC’de, yumurta sarısı daha çok badem ezmesine benzer. Son olarak, 73 oC’de, yumurta sarısı, haşlanmış yumurta haline gelir, ancak kükürt kokusu olmaz ve dışı yeşil değildir.

YAVAŞ PIŞIRME EN UYGUN SICAKLIĞI SAĞLAR

Cardenas’ın katıldığı bu derste yumurta “Sous Vide” tekniği ile pişirildi. Sous Vide tekniği, yiyeceklerin vakumlu torba içerisinde, sıcaklığı çok hassas bir şekilde sabitlenmiş olan su banyosu kullanılarak düşük bir sıcaklıkta pişirilmesidir.

Bir yumurtayı sous vide banyosunda 40-60 dakika bekletmek, tüm yumurtanın eşit bir şekilde aynı sıcaklığa ulaşmasını sağlar. Tavada yumurta pişirdiğimizde ısı ile temas eden kısımlar, etmeyen kısımlara göre daha yüksek bir sıcaklığa çıkacaktır.

PROTEININ DENATÜRE OLDUĞUNU NASIL ANLARSINIZ?

En başta bahsettiğim gibi Cardenas bir yumurtanın farklı kısımlarının protein bütünlüğünü ölçmek için NanoTemper’in Tycho cihazından yararlanmıştır.

Çiğ yumurta sarısı, çiğ yumurta akı ve haşlanmış yumurta akından oluşan 3 örneğini çırparak sıvı hale getirmiş, sonra her bir örnek için 2 cam kapiler kullanarak toplamda 6 kapiler hazırlamış ve bunları Tycho cihazına yerleştirmiştir.

Tycho, proteini oluşturan amino asitlerin intrinsik floresans özelliğini kullanarak çok hızlı bir ısıtıp protein bütünlüğünü ölçer. Bir proteine dış etkenler uygulandığında (ısı, çözeltinin asitliğindeki değişiklikler, diğer proteinler tarafından bozunma vb.) katlı yapısı bozulacaktır. Basitçe, Tycho, dış etmene maruz bırakılan protein ile aynı proteinin normal halini karşılaştırarak yapının bozunup bozunmadığını anlamamıza yardımcı olur. Ve bunu sadece 3 dakika gibi kısa bir sürede yapar!

SONUÇLAR NEYI GÖSTERIR?

Tycho ile elde edilen alttaki grafiklerde X ekseni uygulanan sıcaklık değerlerini, Y ekseni ise tanımlanan ısıtma işlemi sırasında intrinsik floresansdaki değişiklikleri gösterir. Eğride bükülmenin ve bir geçişin meydana geldiği sıcaklığa, bükülme sıcaklığı (Ti) denir.

Sonuçlarda da görüldüğü gibi, yumurtadaki proteinlerin çoğu 60 oC’den sonra denatüre olmaya başlar. Yumurta akında ve sarısında farklı proteinlerin olduğunu da grafik eğrilerinden anlayabiliyoruz. Ayrıca her bir tepe noktası veya dalga boyu oranındaki artış, bir domainde meydana gelen açılmaya karşılık gelir. Proteinlerin çoğu, her bir pikte görebileceğiniz bir domainden oluşur. Bir protein karışımına sahip olduğunuzda, karışımdaki her bir protein için bir tepe göreceksiniz.

Protein katlanmış yapıdaysa, katlanmış ve denatürasyon arasındaki geçişi ölçebilirsiniz, ancak protein veya karışım hâlihazırda çok fazla stres etmeni altındaysa ve denatüre olmuşsa (haşlanmış yumurta akında olduğu gibi) geçiş göremezseniz (Bkz. yeşil ve kahverengi eğriler).

PROTEININIZI NEDEN TEST ETMELISINIZ?

Cardenas Tycho ile yumurtadaki proteinlere bakmış olsa da, siz Tycho ile herhangi bir proteinin saflığını, konsantrasyonunu, fonksiyonel olup olmadığını, saklama koşullarının uygun olup olmadığını kolayca ve zahmetsizce anlayabilirsiniz. Proteinle uğraşan çoğu araştırmacı, deneylerinde birkaç adım atana ve tutarsız sonuçlar görene kadar düşük protein kalitesi nedeniyle bir şeylerin yanlış olduğunu bilmeyebilir. Başlamadan önce numunenizin kalitesini basitçe kontrol edebilseydiniz? Tycho, birçok basamakta proteininizi test edebileceğiniz bir araçtır.

1997’den günümüze temsilcisi olduğumuz CEM firmasının Yașam Bilimleri Bölümü’nde Peptit Sentezi konusunda dünyada yeniliklere imza atan çalıșmalar yürütülmekte. Yalnız cihaz değil, aynı zamanda peptit sentez kimyası ve endüstriyel uygulamalarına yönelik kapsamlı Ar-Ge çalıșmaları özenle gerçekleștirilmekte olup ayrıca peptitler istenilen sekans ve saflıkta son kullanıcıyla bulușturulabilmekte.

CEM’in İș Geliștirme ve Yașam Bilimleri Bölümleri ekibinde yer alan uzmanlar Sayın Keith A.Porter, Jonathan M. Collins, Michael J.Karney ve Sandeep K. Singh, Otomasyon ve Mikrodalga Destekli Isıtma ile mg’dan kg mertebesine cGMP peptit üretiminin Liberty serisi ile kararlı, efektif ve yüksek verimlilikte gerçekleștirilebileceğini gösteren çalıșmaya imza atmıșlar. Gelin hep beraber detaylarını inceleyelim.

ÖZET

Peptitler, doğal olarak sahip oldukları yüksek potensleri, düșük toksisiteleri ve geniș bir hedef yelpazesini etkileme kabiliyetleri nedeniyle ideal ilaç adaylarıdır[1]. Piyasadaki birkaç yüksek gelirli peptit ilaç ve sıradaki potansiyel adaylardan[2] dolayı, yüksek kararlılık ve etkinliğe sahip sentetik bir metota olan ihtiyaç oldukça önem kazanmıștır[3]. Șu anda, hem peptit sentezi araștırmaları hem de peptit üretimi, benzer zorluklarla karșı karșıyadır – optimizasyona çok ciddi derecede ihtiyaç duyan yavaș ve yüksek miktarda atık olușturan iș akıșları. Tipik geleneksel optimizasyon adımları genellikle shotgun (așağıdan yukarıya tarama) yaklașımını benimser: reçinelerin taranması, farklı reaktif fazlalıklarının taranması, aktivatörlerin taranması gibi, vb. Bu sentetik süreç, tamamlanması haftalar ya da aylar süren onlarca ya da yüzlerce reaksiyon için çok uzun bir zamana ihtiyaç göstermekle birlikte maliyet ve kaynakların harcanmasına neden olacaktır. Pazarın ihtiyaçlarını karșılamak için otomasyon ve mikrodalga destekli ısıtma kullanılarak yeni cGMP metodolojisi geliștirilmiștir. Bu çalıșma, katı faz peptit sentezinin kimyasal metodolojisindeki mekanik tabanlı, yenilikçi iyileștirmeleri, bu iyileștirmelerin peptit așıları yoluyla kișiselleștirilmiș tıp için yüksek verimli SPPS’ye uygulanmasını [4,5] ve cGMP ile büyük ölçekli peptit üretimini detaylandırmaktadır.

ÖRNEK ÇALIȘMA 1

• 25 mmol üretim (12 saat)

• >30 amino asit

• 0,35 mmol/g Wang PS reçine

• Reaktifler: 4 kat fazlalıkta

TARTIȘMA

◊ İyileștirilmiș karbodiimid bağlama metodu

• Düșük seviyede epimerizasyon

• Daha az baz kaynaklı yan-reaksiyonlar

• Yüksek sıcaklık stabilitesi

• Yüksek Ham Saflık değeri

◊ Yan reaksiyonları azaltmak için kimyasal grupların bulundurulması

• Fmoc-Asp(OMpe), aspartimid olușumunu baskılar

• Fmoc SPPS’te Fmoc-His(boc)-OH kullanımı His(trt) kullanımını geride bırakıyor ◊ cGMP standartları ile uyumlu otomasyon ve metodoloji

• 21 CFR 11

• Risk analizi

• Sıcaklık validasyonu

YÜKSEK-VERİMLİ PEPTİT ÜRETİMİ

• Protokolün validasyonu Faz 1 așamasındaki bazı peptitler için Terasaki ve çalıșma arkadașları tarafından test edilmiștir[4].

• Peptitler 0,4 mmol (0,40 mmol/g Rink amide AM PS reçinesi) skalasında Prime metodolojisi kullanılarak ardıșık olarak sentezlenmiștir.

• Çok yönlülüğü ve sağlamlığı göstermek için uzun zor sekanslar seçilmiștir.

• Otomatize ardıșın SPPS uygulanmıștır.

• Toplam atıkta %95 azalma tespit edilmiștir. • Yüksek-Verimlilik: 24 saatte 24 peptit sentezi gerçekleștirilmiștir.

PERFORMANS: Liberty PRIME™

ÖRNEK ÇALIȘMA 2

• 9mer

• 700 mmol üretim (9 saat)

• 0,75 mmol/g Rink amide AM PS reçine

• Reaktifler: 2 kat fazlalıkta

KİȘİSEL AȘILAR İÇİN PEPTİT SEKANSLARI Toplam sentez zamanı = 12 saat, 15 dakika Toplam atık miktarı = 3,08 Litre

ZOR SEKANSLARIN SENTEZİ (UPLC-MS)

PEPTİT ÜRETİMİ: Liberty PRO™ • 3 L, 8 L, 15 L reaktör boyutu vardır – tek bir üretimde 1 kg ham peptide kadar sentez imkanı

• 15 ardıșık bağlama reaksiyonuna kadar otomatize edilebilir

• Ar-Ge skalasından Üretim skalasına olağanüstü ölçeklendirebilme özelliği

• API’lerin (Aktif Farmasötik bileșenler) cGMP üretimi [1] D. J. Craik, D. P. Fairlie, S. Liras, D. Price. Chem Biol Drug Des, 2013, 81, 136; [2] K. Fosgerau, T. Hoffman. Drug Discov Today, 2015, 20, 122; [3] J. M. Collins, K. A. Porter, S. K. Singh, G. S. Vanier. Org. Lett. 2014, 16, 940; [4] P. A. Ott et al. Nature, 2017, 547, 217; [5] R. Takahashi et al. Breast Cancer Research, 2014,16, R70.