汉江中下游硅藻群落时空分布及其影响因素研究

刘清香 王婷 许旭明 等

ACTA Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis - - 北京大学学报 - 北京大学学报(自然科学版) 第 54 卷 第4 期 2018 年 7 月Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 54, No. 4 (July 2018) doi: 10.13209/j.0479-8023.2018.005

1. 北京大学深圳研究生院环境与能源学院, 深圳 518055; 2. 北京大学环境工程系, 教育部水沙科学重点实验室,北京 100871; † 通信作者, E-mail: nijinren@iee.pku.edu.cn

摘要 为研究汉江中下游水体和沉积物硅藻的时空分布特征及其影响因素, 于2014年春、秋两季对汉江中下游5个监测断面的硅藻群落进行监测。基于18S RRNA Illumina Miseq高通量测序技术的鉴定结果, 共得到硅藻3纲28目49科111属160种, 其中沉积物硅藻占98.6%。物种丰度显著多于已有研究的结果, 体现了高通量测序技术在硅藻物种鉴定上的优势。水体和沉积物硅藻群落组成和优势种有显著差异, 水体中硅藻优势种为Pinnularia, Cyclotella和nitzschia, 沉积物中硅藻优势种为Pinnularia, Nitzschia和navicula。汉江中下游硅藻群落多样性的时空差异明显, 硅藻多样性存在空间异质性, 且沉积物硅藻比水体硅藻多样性丰富; 在季节影响方面, 表现为秋季硅藻物种多样性比春季丰富。总氮、氨氮、硝态氮和总磷等环境因素对硅藻群落组成影响较大, 因此氮磷控制对避免汉江中下游硅藻水华发生具有重要意义。关键词 高通量测序; 汉江; 硅藻; 时空分布; 环境因子中图分类号 X835

硅藻是种类最多的一种浮游植物, 现存物种数量为30000~100000种[1], 能提供的初级生产力约占全球的1/4[2]。河流中硅藻的密度和生物量可达到藻类总数的60%以上[3]。硅藻繁殖率高, 生命周期短,对水体中环境因子(温度、酸碱度、电导率和营养盐等)的变化能快速做出响应[4], 因此成为河流监测和评价的重要指示生物[5]。然而, 一些硅藻(如冠盘藻、小环藻和直链藻等)是河流水华的优势种[6–8],严重破坏了河流生态系统的稳定性。对河流系统中硅藻的群落进行鉴定, 对全新地认识和开发河流以及维护河流健康有重要意义。硅藻的鉴定方法主要有传统形态学鉴定和分子生物学法。形态学鉴定法依据细胞表面特征(如大小、形状和内部结构等)的差异进行分类。然而,对于一些以单细胞形式存在、细胞尺寸较小的硅藻, 形态学鉴定方法不够准确, 且易受环境因素和

[3]营养条件等的影响 。基于高通量测序技术(highthroughput sequencing)的分子生物学鉴定方法能一次对几十万到几百万条DNA分子进行并行测序, 随着测序技术的发展, 以Illumina测序平台为基础的分子生物学鉴定技术在藻类研究领域中开始广泛应用, 为藻类分类鉴定提供了更准确的方法, 弥补了传统形态学鉴定方法的缺陷。目前, 基于硅藻18S RDNA的高通量测序技术已有大量报道[9–12]。

汉江流经陕西、湖北两省, 是国家“长江经济带”的有机组成部分。受经济发展及污水大量排放的影响, 汉江中下游硅藻水华现象日益突出。然而,当前研究主要从形态学角度分析浮游硅藻引起的水华[13–19], 从分子水平分析硅藻群落的研究较少, 且

[20]未见汉江中下游表层沉积物硅藻的报道 。本研究基于Illumina Miseq高通量测序技术, 选择18S RRNA基因序列, 开展汉江中下游硅藻时空分布及其与环境因子关系的研究, 克服了形态学分析方法主观因素影响较大、分析不够准确的缺点, 可为汉江中下游硅藻的分布特征提供基础数据资料, 也为开发利用和保护汉江中下游水资源与水环境提供一定理论依据。

研究地区与研究方法1.1研究区域与样点设置

汉江是长江第一大支流, 发源于陕西省秦岭南麓, 在武汉龙王庙汇入长江。丹江口至钟祥河段为中游, 河道长270 km, 流域面积为4.68×104 km2。钟

祥至汉口龙王庙为下游, 流经江汉平原, 河道长382 km, 流域面积为1.7×104 km2。汉江流域气候温和,平均气温为16°C, 年平均降水量为700~1300 mm,多集中在5—10月。径流量年际变化较大, 丰水年平均流量为3310 m3/s, 枯水年平均流量为572 m3/s[13]。汉江沿途接纳工业废水和市镇污水约7亿t/a, 水体富营养化严重, 容易发生水华[14], 水华的主要优势种是硅藻。

根据汉江中下游的水体形态, 设置 5 个采样点(图 1), 于 2014 年 3 月(春季)和 10 月(秋季)分别对水体和沉积物进行采集。水样利用采水器进行采集, 为河道三线九点等体积混合水; 在同一断面使用采泥器采集表层沉积物样品。样品分别标记为SW (春季水样)、SS (春季沉积物)、FW (秋季水样)和 FS (秋季沉积物)。基于化石硅藻的推理模型, 本研究选取的时间段可获得最具代表性的硅藻环境样品[21]。

1.2 样品采集与分析

采集的水样分为两份, 其中一份用于硅藻的分子生物学鉴定, 另一份用于水化学指标分析。

用于硅藻分子生物学鉴定的水样于24小时之内用0.22 μm聚碳酸酯滤膜(millipore, USA)过滤后保留滤膜, 再用FASTDNA SPIN Kit for Soil试剂盒提取DNA。沉积物样品离心去水后, 采用同样的方式提取DNA。每个样本进行3~5次DNA抽提并进行混合, 组成该样本的DNA样品。吸取5 μl DNA样品,用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性, 用

Nanodrop 2000进行定量。在对DNA样品进行PCR扩增时, 参照Visco等[12]的方法, 对18S RRNA的V4区进行PCR扩增(ABI Geneamp® 9700型), 然后使用AXYPREPDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN, USA),切胶回收PCR产物, Tris_hcl洗脱; 2%琼脂糖电泳检测。最后, 由上海美吉生物医药科技有限公司构建18S RRNA基因V4区测序文库, 并进行 Illumina Miseq测序。硅藻鉴定分类参照美国国家生物技术信息中心

[22] (NCBI)和Medlin等 的分类方法, 将硅藻门分为Coscinodiscophytina 亚门和 Bacillariophytina 亚门,其中Coscinodiscophytina亚门下属硅藻纲(coscinodiscophyceae), Bacillariophytina 亚门下属硅藻纲(Bacillariophyceae)和中型硅藻纲(mediophyceae)。

另一部分水样用于检测水体的电导率(Cond)、ph、总氮(TN)、总磷(TP)、氨氮(NH3-N)、硝氮(NO3-N)、COD和溶解氧(DO)等指标, 检测方法参考HJ/T91-2002《地表水和污水检测技术规范》。

1.3 数据分析

为分析硅藻的多样性及时空分布差异, 本研究采用的统计分析方法包括多样性分析、NMDS分析、Lefse分析和heatmap分析。

采用 MOTHUR 软件计算样品的 OUT (operational taxonomic unit)丰度和 Shannon 多样性指数。利用 Shannon 指数评估群落物种多样性(α 多样性), Shannon 值越大, 说明群落多样性越高。覆盖率(Coverage)指数用于评价样品的覆盖度和测序深度是否足够, Coverage 数值越大, 表明样品中所有物种被测出来的概率越大, 没有被测出来的物种越少。

非度量多维尺度分析(NMDS)方法根据水体和沉积物硅藻的时空分布, 分析可视化所有样品两两间的Unweighted-uinfrac距离, 进而分析因硅藻群落组成时空差异而产生的β多样性。

LEFSE (linear discriminant analysis effect size)分析方法主要是通过Kruskal-wallis参数因子和秩验检来实现。根据分类学组成, 按照不同的分组条件,对样品进行线性判别分析(LDA), 找出对样品划分产生显著性差异影响的群落或物种。

相关性Heatmap分析方法通过计算各环境因子与所选物种或Otu之间的相关性(pearson系数), 用颜色梯度来反映物种与环境因子的相关性, 进而揭示影响硅藻物种多样性与丰度的关键环境因子。

2 结果与讨论2.1 硅藻物种组成和优势种

各个样本的Coverage指数范围为99.39%~99.79%,平均值为99.50%, 证明样本中几乎所有的硅藻信息均被检测出。此次调查共得到1436个OTU, 春季水样、春季沉积物、秋季水样和秋季沉积物样品分别含479, 855, 626和879个OTU, 4组样品共有的OTU为247个。对每个OTU进行从门到种的注释, 鉴定硅藻共3纲28目49科111属160种, 其中春季28目47科101属139种, 秋季28目49科102属148种, 比形态学鉴定的物种数[13,17,23]多,表明高通量测序技术对硅藻多样性的鉴定更全面, 可对现有物种鉴定方法进行有效的补充。采集的样品中, 沉积物硅藻占总物种数的98.6%, 表明沉积物是长江生态系统硅藻物种的存储库。在属水平上, 丰度居前30的物种占总数的97.2%, 因此本研究选择该范围的物种分布来分析春季水体、春季沉积物、秋季水体和秋季沉积物的硅藻群落结构, 结果如图2所示。水体硅藻的优势种为Pinnularia, Cyclotella和nitzschia, 占比分别达到24.1%~40.3%, 1.2%~9.1%和1.1%~8.3%, 其次为Plagiogrammopsis, Aulacoseira, Navicula, Asterionella, Porosira, Thalassiosira和cyclostephanos。沉积物优势种为Pinnularia, Nitzschia和navicula, 占比分别达到12.2%~29.8%, 3.5%~13.7%和1.9%~5.2%, 其次为Sellaphora, Cyclotella, Surirella, Cymatopleura, Aulacoseira, Porosira 和 Amphora 等。此外, 尚未分类部分的物种 (Environmental_samples_norank) 达到15.3%~49.8%, 说明自然环境中尚有很多未知硅藻会不断被发现[1], 其分类体系还需不断完善。

大量研究表明, 引起汉江硅藻水华的优势物种为小环藻属(Cyclotella)[13], 而郑凌凌[19]结合形态学和分子生物学方法研究得到的硅藻水华优势种为直链藻属(Aulacoseira)和冠盘藻属(Stephanodiscus)。本研究得到的汉江中下游硅藻优势种为羽纹藻属(Pinnularia)、菱形藻属(nitzschia)和小环藻属(cyclotella),与已有研究结果有所不同, 可能得益于水环境污染治理的加强, 使汉江中下游水体中氮磷等营养盐浓度降低, 硅藻水华现象得到很大程度的缓解, 硅藻优势种也随之变化。

2.2 硅藻物种多样性

汉江中下游春季水体、春季沉积物、秋季水体和秋季沉积物中硅藻的Shannon多样性指数变化范

1. 丹江口坝下 (32.51°N, 111.51°E); 2. 陶岔 (32.66°N, 111.66°E); 3. 襄阳(32.03°N, 112.15°E); 4. 仙桃(30.38°N, 113.45°E); 5. 集家嘴(30.57°N, 114.23°E)图 1研究区域及采样点Fig. 1 Research area and sampling sites

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