维药成熟与清除疗法对咸味黏液质型银屑病血清代谢组学的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - Chinese Journal Of Information On Traditional Chin -

努尔比艳木•阿布都热合曼1,2,塔依尔•吐尔松 1,买吾拉尼江•依孜布拉1,马丽娜 3,

毛吾丽旦木•迪力夏提1,阿米尔•艾力2,努尔买买提•艾买提 1

1.新疆医科大学维吾尔医学院,新疆 乌鲁木齐 830011;2.阿克苏地区维吾尔医医院,新疆 阿克苏 843000;

3.新疆医科大学中心实验室,新疆 乌鲁木齐 830011

摘要:目的 通过代谢组学方法,研究咸味黏液质成熟与清除疗法对咸味黏液质型银屑病患者体内物质代谢的影响。方法 采用核磁共振(NMR)技术测定维药咸味黏液质成熟与清除疗法治疗前后咸味黏液质型银屑病患者及健康志愿者血清代谢物,使用正交偏最小二乘法判别分析研究血清内源性化合物在治疗前组、治疗后组与正常对照组间的差异。结果 与正常对照组比较,治疗前组血清中极低密度脂蛋白、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、乳酸、乙酸、糖蛋白、乙酰半胱氨酸、谷氨酰胺、丙酮、肉碱、肌酸、丙二酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、肌醇、胆碱、甘氨酸、低密度脂蛋白明显升高,酪氨酸、组氨酸、甲酸明显降低

(P<0.05)。与治疗前组比较,治疗后组血清中 β-葡萄糖、α-葡萄糖明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 咸味黏液质型银屑病患者血清中氨基酸代谢、脂类代谢、糖代谢等出现不同程度异常。维药咸味黏液质成熟与清除疗法可能通过调节患者体内紊乱的糖代谢来实现治疗作用。关键词:成熟与清除疗法;咸味黏液质;银屑病;代谢组学

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.007

中图分类号:R291.5;R275.986.3 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)04-0024-05

Effects of Uyghur Medicine Munziq and Mushil's Therapy on Serum Metabolomics of Abnormal Phlegmatic Type Psoriasis

Nuerbiyanmu Abudureheman1,2, Tayirjan Tursun1, Maiwulanijiang Yizibulla1, MA Li-na3, Maowulidanmu Dilixiati1, Amier Aili2, Nurmuhamat Amat1 (1. College of Traditional Uyghur Medicine of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China; 2. Hospital of Traditional Uyghur Medicine of Aksu Region, Aksu 843000, China; 3. Central Laboratory of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

Abstract: Objective To investigate the effects of Uyghur Medicine Munziq and Mushil’s therapy on the metabolic changes in serum of patients with abnormal phlegmatic type psoriasis by NMR based metabonomic method. Methods NMR technology were used to detect serum of patients with abnormal phlegmatic type psoriasis before and after treated by Munzig and Mushil’s therapy. OPLS-DA was used to study the differences of serum endogenous compounds between pre-treatment, post-treatment and normal control groups. Results Compared with normal control group, levels of some metabolites including VLDL, isoleucine, leucine, valine, lactate, threonine, alanine, methionine, acetic acid, glycoprotein, acetylcysteine, glutamine, acetone, carnitine, creatine, malonic acid, β-glucose, α-glucose, inositol, choline, glycine and LDL in serum increased significantly, while levels of tyrosine, histidine, and formic acid decreased significantly (P<0.05). Compared with before treatment, levels of β-glucose and α-glucose decreased significantly after treatment, with statistical significance (P<0.05). Conclusion The levels of amino acid metabolism, lipid metabolism and glucose metabolism in patients with abnormal phlegmatic type psoriasis are abnormal to different degrees. The treatment of Uyghur Medicine Munziq and Mushil’s therapy may be achieved through regulating the disorder of glucose metabolism in the patient.

Key words: Munziq and Mushil's therapy; abnormal phlegm; psoriasis; metabonomics

银屑病(psoriasis)是一种常见的免疫介导的慢性炎症性复发性皮肤病,世界范围内自然人群发病率为 2%~3%[1-2]。其发病机制迄今未明确,尚无有效的治疗方法,研究有效的防治方法已成为众多医学工作者面临的一项迫切任务。体液论是维吾尔医学的核心,胆液质、黏液质、血液质、黑胆质4种体液的异常变化都可导致银屑病,其中黏液质的异常变化最常见。代谢组学可以反映生命个体对外源性物质的刺激、环境变化或遗传修饰所作出的所有代谢应答的全貌和动态变化过程。

本研究以咸味黏液质型银屑病患者为研究对象,采用核磁共振(NMR)测定技术测定患者治疗前后血清代谢物成分及相对含量,观察咸味黏液质型银屑病患者与正常人的特异性代谢标志物,为银屑病的早期诊断和治疗提供依据。

1 资料与方法 1.1 一般资料

选择 2015 年 7 月-2016 年 3 月阿克苏地区维吾尔医医院咸味黏液质型银屑病住院患者 38 例。其中男性 17 例,女性 21 例;年龄 10~57 岁,平

均(28.89±11.67)岁;病程最短 1 个月,最长 24年;皮损发生在全身、躯干、四肢等部位。健康对照组选取新疆医科大学第一附属医院体检中心无血缘关系及性别、民族、年龄构成均无差别的健康志愿者 31 人,年龄 15~53 岁,平均(28.45±9.18)岁。病例组与正常对照组年龄、性别等差异无统计学意义

(P>0.05),具有可比性。本研究经阿克苏地区维吾尔医医院伦理委员会批准。

1.2 西医诊断标准

依据《现代皮肤病性病治疗学》[3]单纯性进行期银屑病诊断标准。

1.3 维吾尔医诊断标准及体液分型

参照《维吾尔医皮肤病学》[4]咸味黏液质型银屑病拟定。主症:银白色鳞屑,可见薄膜现象,点状出血点。次症:皮损较深结节,鳞屑厚积,瘙痒较为严重,伴有便秘,小便色黄,舌质红,苔黄腻,脉粗硬快。

1.4 纳入标准

①符合西医诊断标准、维吾尔医诊断及体液分型标准者;②年龄 10~65 岁,性别不限;③近 2 周未使用过糖皮质激素及免疫抑制剂、维A酸类药物者; ④患者和健康志愿者知情同意。

1.5 排除标准

①门诊患者;②孕妇或哺乳期妇女;③脓疱型、关节型、红皮病性银屑病者;④合并心、脑、肝等系 统严重器质性疾病及造血系统疾病者;⑤精神病患者。

1.6 仪器与试剂

NMR 波谱仪(600 MHz,美国 Varian 公司);NMR波谱仪工作站(美国 Varian 公司);低温超速离心机(美国 Beckman 公司);-80 ℃超低温冰箱(中国海尔公司);核磁管。重水(美国 CIL 公司);NaCl、K2HPO4、NaH2PO4(天津市光复精细化工研究所);蒸馏水。

1.7 治疗方法

患者于住院第2日清晨予咸味黏液质成熟剂(含牛舌草、铁线蕨、玫瑰花、地锦草、西青果、菊苣子、小茴香、土茯苓、香青兰等,浸泡 4 h,煎煮提取,阿克苏地区维吾尔医医院药剂科提供),按患者年龄及体质口服 70~100 mL,每日 3次,连续 15 d。第16日清晨予咸味黏液质清除剂(含西青果、罗望子、毛诃子肉、清泻山扁豆、地锦草、番泻叶、薰衣草、破布木瓜、黄诃子、牛舌草、红枣等,浸泡 4 h,煎煮提取,阿克苏地区维吾尔医医院药剂科提供),按年龄及体质口服 70~100 mL,每日 3次,连续3 d。

1.8 样品采集与处理

清晨空腹采集健康志愿者、患者(住院次日、19~

20 d)血液 5 mL,3000 r/min 离心 10 min,分离血清,

放置在-80 ℃冰箱保存。进行 1H-NMR 测试时,将血清解冻,取 200 μL,每个样本加入 400 μL重水配制

的磷酸盐缓冲液(NaCl、K2HPO4、NAH2PO4,1.5 mol/L,

pH7.4)混匀,以避免 pH值对化学位移的影响,配制完成后室温放置 10 min,4 ℃,10 000 r/min 离心

10 min,取上清液 550 μL,放入 5 mm核磁管中进行测试。

1.9 血清核磁共振氢谱测定

氢谱测定在 Inova 600 型 NMR 波谱仪上采用

NOESYPRESAT-1D(RD-90º-t1-90º-tm-90º-ACQ)脉冲序列进行。对 1H-NMR 频率为 600 MHz,累积扫描

64次,采样数据点32 768,谱宽 10 000 Hz,采样延迟 2 s,每次扫描时间均为 1.64 s,测试温度 25 ℃,

采用预饱和方法压制水峰。1H-NMR实验步骤:将盛有样品的核磁管放入核磁共振波谱仪中,按照顺序进行匀场锁场、序列选择、参数设置等,进行采样,最后得到谱图。

1.10 数据处理与分析

样品的 1H-NMR 谱全部用 Topspin2.0 软件(德国Bruker 公司)进行手动基线及相位调整。1H-NMR谱以 α-葡萄糖左峰质子信号作为化学位移参考峰的位置,设为 5.233 ppm。为了消除 pH值变化引起的化学

位移偏差,将谱图在 9.0~0.5 ppm区域内以积分区间设为 0.003 ppm进行一次自动分段积分。将积分值以文本形式保存且导入 Excel2007 中,为消除 4.72~

5.15 ppm区段的残留水信号对分析结果的影响,故删去此区间数据。

对上述处理好的数据矩阵进行归一化处理后进行数据多元统计分析。将归一化处理后剩余数据用

SIM-CA-P+11 软件(瑞士 Umetrics 公司)进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)进行统计分析。通过 OPLS-DA所获得的代谢物相关系数判断3组血清样品的差异性代谢成分,提高分析结果的可信度。

本研究采用代谢物相关系数来确定正常对照组与治疗前组、正常对照组与治疗后组、治疗前组与治疗后组的差异性代谢成分,检验标准 P=0.05。通过皮尔森相关系数(r)显著性差异检测,确定|r|>

0.349(n=30)、0.304(n=40)所代表的代谢物为有

统计学意义(P<0.05)的代谢物。|r|越大表示差异性越大,反之越小。

2 结果

2.1 3组血清一维氢谱正常对照组、治疗前组、治疗后组1H-NMR 谱见图 1。2.2 一维氢谱空间分布

通过对 1H-NMR 谱进行分段积分的积分值进行OPLS-DA 分析,得到 3D 空间分布图,3 组 Q²值依次为 0.746、0.902、0.464,见图 2。正常对照组与治疗前组代谢物具有一定差异性,3 组的代谢模式较为规律。

2.3 各组血清差异性代谢物

正常对照组与治疗前组、正常对照组与治疗后组、治疗前组与治疗后组血清差异性代谢物及相关系数见表1、表 2。正常对照组/治疗前组、正常对照组/治疗后组、治疗前组/治疗后组比较,R²X值分别为 0.701、0.761、0.684,Q²值分别为 0.746、

0.902、0.464。正常对照组与治疗前组血清多种代谢组分有明显差异。与正常对照组比较,相关系数为正值的差异性代谢物表示在治疗前组含量降低的化合物,相关系数为负值的差异性代谢物表示在治疗前组含量升高的化合物。与治疗前组比较,相关系数为正值的差异性代谢物表示在治疗后组含量降低的化合物,相关系数为负值的差异性代谢物表示在治疗后组含量升高的化合物。正常对照组与治疗前组血清中变化明显的主要差异性代谢物有极低密度脂蛋白(VLDL)、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、丙二酸、蛋氨酸、乳酸、乙酰半胱氨酸、谷氨酰胺、乙酸、丙酮、肉碱、肌酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、糖蛋白、肌醇、胆碱、甘氨酸、低密度脂蛋白(LDL)、酪氨酸、组氨酸、甲酸等。与正常对照组比较,治疗前组血清中多种代谢产物有明显差异,其中VLDL、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、乳酸、乙酸、糖蛋白、乙酰半胱氨酸、谷氨酰胺、丙酮、肉碱、肌酸、丙二酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、肌醇、胆碱、甘氨酸、LDL 明显升高,酪氨酸、组氨酸、甲

酸明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗前组与治疗后组血清变化明显的主要差异性代谢物有β-葡萄糖、α-葡萄糖。与治疗前组比较,治疗后组血清中β-葡萄糖、α-葡萄糖明显降低,差异有统计学

意义(P<0.05)。

3 讨论

银屑病患病率在不同地区和民族间差异很大,白种人发病率较高(如美国2.2%),亚洲发病率较低(如

中国<1%)[5],20~30 岁人群发病率较高[6],无性别

[7]差异。该病病程长,难治、易复发,被称为“慢性杀手” 。

银屑病属维吾尔医学“解热比”“库巴”等范畴。维吾尔医学注重体液变化,机体健康与4种体液的正

常及平衡密切相关。4 种体液异常变化均可导致银屑病,其中黏液质异常变化最多见。当体内形成咸味黏液质型体液时,正常生理功能受损,体内异常代谢产物增多,并通过血液循环到达皮肤组织和细胞间隙,破坏皮肤正常代谢功能而致银屑病。维药咸味黏液质成熟清除疗法主要治疗咸味黏液质导致的人体机能

异常状态,维持人体体液相对平衡[8]。成熟剂被人体吸收后阻止过盛的咸味黏液质体液数量,降低其刺激性;并增加组织间液,使组织和细胞间隙中沉淀的咸味黏液质逐渐溶解变稀,从而易被咸味黏液质清除剂排出体外。清除剂进入胃肠将食物中可形成咸味黏液质体液的物质分解,抑制咸味黏液质体液形成。此外,清除剂强烈刺激肠动静脉,使肠壁血液循环加快。由此,具备排出体外状态的咸味黏液质体液由压力较大的血管开始流向压力较小的肠腔,组织间隙中已经成熟的咸味黏液质体液便可流向血管,使血管内压增强,血管内压又将其挤至肠腔最终排出体外。维药地锦草清热解毒、凉血止血,是咸味黏液质成熟与清除

剂主要成分之一,主治皮肤病、瘙痒等疾病[9]。

本研究表明,咸味黏液质型银屑病患者血清中氨基酸代谢、脂类代谢和糖代谢均出现不同程度紊乱。与正常对照组比较,治疗前组血清中异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、乙酰半胱氨酸、肌酸、丙二酸、甘氨酸等明显升高,提示蛋白质代谢异常。其中异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸是支链氨

基酸,在调节氨基酸与蛋白质代谢上起重要作用[10]。咸味黏液质型银屑病患者血清中支链氨基酸含量明显增加,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<

0.05),表明患者体内蛋白质分解过程增加,合成过程被抑制,该结果基本符合银屑病表皮更替时间缩短的

组织病理学学说[11]。与治疗前组比较,治疗后组患者血清中各种氨基酸未见明显变化,说明维药成熟与清除疗法对血清氨基酸代谢影响不明显。血清VLDL、LDL含量明显升高、乳酸增加,可能与机体能量代谢障碍和氧化损伤有关。肌酸和磷酸肌酸是体内能量储存、利用的重要化合物,本研究中患者血清肌酸含量显著升高,提示患者体内能量代谢发生紊乱。脂肪酸在肝细胞线粒体中进行分解代谢所生成的特殊中间产物丙酮,作用于肝细胞生成后进入血液循环。正常人血液中酮体含量极少,如果脂肪利用率增加,酮体

生成则增加,血中酮体浓度增高[12]。同时,治疗前组与脂肪代谢有关的肉碱量显著增加,与正常对照组比

较差异有统计学意义(P<0.05)。糖蛋白对维持免疫功能起重要作用,可保护上皮细胞完整性、增加淋巴

细胞总数,增强机体免疫功能等[13]。治疗前组患者血清糖蛋白含量明显升高可能与机体对致病因素产生免疫应答有关。

组氨酸能被分解成氨、谷氨酸和甲酰胺,参与基础能量代谢。体内组氨酸酶催化组氨酸脱氨生成尿苷酸的代谢途径受阻,引起组氨酸积聚,组氨酸浓度显

著升高,尿中组氨酸含量增多[14]。本研究中患者组氨酸含量明显降低,说明体内基础能量代谢发生异常。与治疗前组比较,治疗后组患者血清β-葡萄糖、α-葡

萄糖含量明显降低(P<0.05),说明维药咸味黏液质成熟与清除疗法具有调节糖代谢紊乱的作用。

总之,咸味黏液质型银屑病患者血清中糖代谢、脂类代谢和氨基酸代谢出现不同程度紊乱。维药咸味黏液质成熟与清除疗法对咸味黏液质型银屑病有一定疗效,通过调节患者体内紊乱的糖代谢来实现。成熟与清除疗法对患者血清氨基酸、脂类代谢作用不明显可能与维药发挥疗效较慢有关,需进一步研究。 参考文献:

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(收稿日期:2016-10-08)

(修回日期:2016-11-02;编辑:季巍巍)

图 2 3组血清 1H-NMR 谱 OPLS-DA 分析 3D空间分布图

注:A.正常对照组;B.治疗前组;C.治疗后组;1.VLDL;2.异亮氨酸;

3.缬氨酸;4.乳酸;5.苏氨酸;6.丙氨酸;7.亮氨酸;8.乙酸;9.糖蛋白;

10.乙酰半胱氨酸;11.蛋氨酸;12.丙酮;13.肉碱;14.丙二酸;15.β-葡萄糖;

16.α-葡萄糖;17.酪氨酸;18.组氨酸;19.谷氨酰胺;20.肌酸;21.甲酸;

22.肌醇;23.胆碱;24.甘氨酸;25.LDL

图 1 3组血清 1H-NMR 图谱

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