玉屏风散及过敏煎合止嗽散对 PM2.5 致 Th17/Treg 失衡诱发肺损伤大鼠的影响

2017-04-15 -

张晓雅 1，2，冯淬灵 3，孟玉凤 1，杜建超 1，岑锦裳 4，魏永杰 5

1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.沧州市中心医院，河北沧州 061014；

3.北京大学人民医院，北京 100044；4.国药集团广东环球制药有限公司，广东广州 528303；

5.中国环境科学研究院环境基准和风险评估国家重点实验室，北京 100012

摘要：目的观察 PM2.5 致辅助性T细胞 17（TH17）与调节性 T细胞（Treg）失衡诱发的大鼠肺损伤及不同中药治法的干预作用。方法将 SPF 级雄性 Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、中药1组和中药2组。采用气道滴注方法建立 PM2.5 致肺损伤模型，模型组和正常组予生理盐水灌胃，中药 1 组和及中药 2 组分别予玉屏风散及过敏煎合止嗽散灌胃。ELISA 检测各组肺泡灌洗液（BALF）及血清白细胞介素（IL）-17、IL-10、

IL-8、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、黏蛋白（MUC）5AC含量；免疫组化检测肺组织 Foxp3、IL-17 的表达。结果与正常组比较，模型组血清和BALF IL-8、IL-17、NE、MUCAC 含量显著升高，IL-10 含量明显降低

（P＜0.05，P＜0.01），肺组织 IL-17 蛋白表达明显增加、Foxp3蛋白表达明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，中药 1组及中药2组血清和 BALF IL-8、IL-17、NE 含量明显降低，BALF IL-10 明显升高，中药2组血清 IL-10

明显升高（P＜0.05），肺组织 IL-17 蛋白表达明显降低、Foxp3 蛋白表达明显增加（P＜0.01），病理学变化明显改善。结论 PM2.5可通过引起 Th17/Treg失衡诱发肺损伤，玉屏风散及过敏煎合止嗽散均可明显改善PM2.5致大鼠肺组织病理损害，并可改善PM2.5 导致的 TH17/Treg 失衡。

关键词：玉屏风散；过敏煎合止嗽散；PM2.5；肺损伤；辅助性T细胞17；调节性 T细胞；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.012

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2017)04-0045-05

Effects of Yupingfeng Powder and Guomin Decoction Combined with Zhisou Powder on Lung Injury Rats Caused by Imbalance of Th17/Treg Induced by PM2.5

ZHANG Xiao-ya1,2, FENG Cui-ling3, MENG Yu-feng1, DU Jian-chao1, CEN Jin-shang4, WEI Yong-jie5 (1. Dongzhimen Hospital Attached to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; 2. Cangzhou Central Hospital, Cangzhou 061014, China; 3. People’s Hospital of Peking University, Beijing 100044, China; 4. Sinopharm Group Guangdong Medi-World Pharmaceutical Co, Guangzhou 528303, China; 5. State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China)

Abstract: Objective To observe the lung injury of rats caused by PM2.5 induced imbalance of TH17/Treg immune system and the intervention effect of two different TCM treatments. Methods Wistar male rats were randomly divided into normal group, model group, TCM-treated group1 and TCM-treated group 2. PM2.5-induced lung injury model was established by airway instillation. Model group was given normal saline for gavage. TCMtreated group 1 and 2 were given Yupingfeng Powder and Guomin Decoction combined with Zhisou Powder for gavage. The pathological changes of bronchial and lung tissues, the contents of IL-8, IL-10, IL-17, NE, and MUC5AC in serum and BALF were compared, and the expressions of Foxp3 and IL-17 in lung tissue of each group were analyzed. Results Compared with normal group, the contents of IL-8, IL-17, NE and MUC5AC in serum and BALF of model group increased significantly, while IL-10 decreased significantly (P<0.05, P<0.01); the expression of IL-17 increased significantly and the expression of Foxp3 decreased significantly in lung tissue (P<0.01). Compared with 基金项目：北京中医药大学自主课题（2015-JYB-XS161）通讯作者：冯淬灵，E-mail：fengcuiling@sina.com

model group, the contents of IL-8, IL-17, and NE decreased in TCM-treated group 1 and 2, while the content of BALF IL-10 increased significantly (P<0.05). The content of IL-10 in serum increased significantly in TCM-treated group 2 (P<0.05); the protein expression of IL-17 of lung issue decreased significantly, and the protein expression of Foxp3 increased significantly (P<0.01). The pathological changes were improved significantly. Conclusion PM2.5 can induce lung injury caused by the imbalance of TH17/Treg. Both two treatments can significantly improve the lung injury induced by PM2.5 and the imbalance of TH17/Tregs immune system.

Key words: Yupingfeng Powder; Guomin Decoction combined with Zhisou Powder; PM2.5; lung injury; TH17; Treg; rats

（paticulate近年来，空气污染加重，雾霾频现。细颗粒物matter，PM）是雾霾的主要成分。PM2.5有粒径小、面积大、活性强，易附带有毒、有害物质，且在大气中的停留时间长、输送距离远等特点。PM2.5的这些特性决定其表面可以吸附更多有害物质，并且可以自如避开呼吸系统的天然屏障如鼻毛、支气管纤毛等而进入细小支气管及肺组织内，对人体造成更大的损伤。本研究运用过敏煎合止嗽散及玉屏风散干预

PM2.5致大鼠肺损伤模型。前者可祛风固卫、宣肺止咳，后者偏于益气固表、防邪外侵。初步探讨2 种不同治法的干预作用及机制。

1 实验材料

1.1 动物清洁级雄性 Wistar 大鼠 24 只，鼠龄 6～8 周，体

质量（200±20）g，北京维通利华实验动物技术有限

公司，合格证号 11400700124029。饲养于 20～25 ℃、12 h光照清洁的动物房，自由饮水，进食标准饲料。1.2 药物及制备

玉屏风散由黄芪、白术、防风组成，国药集团广东环球制药有限公司加工成浸膏剂，用去离子水配制成 0.8 g/mL；过敏煎合止嗽散由银柴胡10 g、防风10 g、

乌梅 6g、五味子 10 g、陈皮 10 g、桔梗 10 g、炙紫

菀 10 g、制百部 10 g、荆芥 10 g、白前 10 g、生甘草

4 g 组成，购自北京中医药大学东直门医院中药房，北京康仁堂药业有限公司制成颗粒，用去离子水配制成 0.172 g/mL 药液。1.3 主要试剂与仪器

PM2.5石英纤维膜由中国环境科学院提供，采集机器为 TH-16A型大气颗粒物智能采样仪，采集时间为 2015 年 1 月－3月，采集地点为中国环境科学院北段大楼楼顶。每张膜约含 PM2.5 量 120 mg，共 6 张膜，制成 PM2.5 悬液。大鼠白细胞介素（IL）-8酶联免疫试剂盒（E02I0056，Blue Gene），IL-10 酶联免疫试剂盒（CSB-E04595r，武汉华美），IL-17 酶联免疫

试剂盒（CSB-E07451r，武汉华美），黏蛋白/黏液素 5AC（MUC5AC）酶联免疫试剂盒（CSB-E16223r，武汉华美），中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）酶联免疫

试剂盒（CSB-E08847r，武汉华美），兔抗 IL-17 多克

隆抗体（ab79056，Abcam），鼠抗 Foxp3 单克隆抗体

（sc-130666，Santa Cruz）。精密天平（BSA223S-CW，

上海人和科学仪器有限公司），超声震荡器（JP-C100，广州市吉普超声波电子设备有限公司），低温冷冻干燥机（LGJ-10 普通型，北京松源华兴科技发展有限公司）标准规格酶标仪（Multiskan MK3 ， Thermo

Scientific），电热恒温培养箱（SKP-02.600，黄石市恒丰医疗器械有限公司），离心机（3K18，Sigma 公司），摄像装置（Moticcam 2306，麦克奥迪实业集团公司），成像软件系统（Motic Images Advanced 3.2，麦克奥迪实业集团公司）。

2 实验方法

2.1 造模及给药大鼠适应性饲养7 d后随机分为正常组、模型组、中药 1组和中药2组，每组6只。正常组正常饲养，不做干预；模型组实验第 1 日开始第 1 次气道滴注PM2.5 悬液染毒，染毒浓度为8 mg/kg，滴注方法参

照文献[1]，后每隔 2 d 染毒 1 次，共 10 次，最后 1次染毒 48 h后处死大鼠，给予生理盐水灌胃；中药组PM2.5 染毒同模型组，中药 1组予玉屏风散灌胃，中药 2 组予过敏煎合止嗽散灌胃。给药体积均为10 mL/kg，每日 1次，连续 30 d。2.2 一般观察分别于实验第 1、10、20、30 日观察大鼠活动度、呼吸及胸廓起伏、体质量等。2.3 肺组织形态观察

大鼠 10%戊巴比妥（0.3 mL/kg）腹腔注射麻醉，开胸取右侧肺组织，用4%、pH 7.4 多聚甲醛缓冲液固定 48 h，乙醇石蜡包埋，切片（厚度5 μm），供 HE染色及免疫组化测定使用。2.4 肺泡灌洗液和血清相关指标测定麻醉大鼠剪开腹部皮肤及皮下组织，暴露腹主动

脉，抽血8 mL，4 ℃、1000 r/min 离心 10 min，取上

清液，置于-20 ℃冰箱保存。剪开颈部、胸部皮肤，暴露气管及肺脏，剥离气管及左侧肺脏、心脏及胸腺，找到气管分支，结扎右主支气管，经气管注入无菌生理盐水4 mL至左主支气管和左肺，再慢慢回抽，回抽液大约2～3 mL，反复 3次，于4 ℃、1000 r/min离心 10 min，取上清液，置于-20 ℃低温冰箱保存。ELISA 检测大鼠肺泡灌洗液（BALF）和血清 IL-8、

IL-10、IL-17、NE 和 MUC5AC含量；免疫组化法检测大鼠肺组织 IL-17、Foxp3 蛋白表达。取大鼠右下肺切片，每张切片加50 μL生物素标记一抗（1∶100），

37 ℃孵育 40 min，0.01 mmol/L PBS 浸泡 5 min×3

次，滴加二抗，37 ℃孵育 20 min，0.01 mmol/L PBS浸泡 5 min×3 次，每张切片加 100 μL新配制的DAB工作液，镜下观察随时终止反应，自来水浸泡5 min，苏木素复染 3～10 min，自来水浸泡 5 min，晾干，中性树胶封固。应用 Image Pro Plus6.0 图像处理软件进行图像数据处理，计算每张切片的平均光密度（IOD）值。

3 统计学方法

采用 SAS8.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s

—表示，多组间比较采用方差分析，非正态分布采用非参数检验。组间比较，若服从正态分布则采用两独立样本t检验，若不服从正态分布则采用秩和检验。P＜ 0.05表示差异有统计学意义。

4 结果 4.1 一般情况

正常组大鼠毛发光泽度好，饮食正常，呼吸运动正常，体质量缓慢增长；模型组大鼠毛发光泽度较正常组差，呼吸运动基本正常，时有躁动，体质量增长较缓慢；中药1组和中药2组大鼠毛发光泽度与模型组相差不大，呼吸基本正常，体质量缓慢增长，平时较安静。结果见表1。

4.2 中药对模型大鼠病理形态的影响

正常组大鼠支气管和肺组织周围有极少量炎性细胞浸润，肺泡结构完整，分布均匀，肺毛细血管管壁结构完整。模型组大鼠肺组织支气管、血管及肺泡间隔内中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等多种炎性细胞浸润；小支气管管壁增厚，可见少量杯状细胞增生，管腔内伴有少量出血及渗出；肺泡间隔明显增厚，部分肺泡间隔断裂，肺泡腔增大，肺泡结构消失；肺毛细血管管壁增厚明显。中药组大鼠支气管、肺泡间隔及肺毛细血管周围炎性浸润情况明显改善，支气管黏膜损伤改善，肺泡间隔增生缓解，肺毛细血管壁增厚减轻，结构较完整。结果见图1。

—

4.3 中药对模型大鼠血清和肺泡灌洗液中相关指标含量的影响

与正常组比较，模型组血清和及 BALF IL-8、

IL-17、NE、MUC5AC 含量明显升高，IL-10 含量明

显降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，中药组血清和 BALF IL-8、IL-17、NE 含量明显降低（P＜

0.05），中药 1组BALF和中药2组血清和BALF IL-10

明显升高（P＜0.05）。结果见表 2、表 3。

—

4.4 中药对模型大鼠肺组织白细胞介素-17、Foxp3蛋白表达的影响

模型组较正常组 IL-17 蛋白表达明显升高、Foxp3

蛋白表达明显降低（P＜0.01）；中药 1组和中药2组肺组织较模型组 IL-17 蛋白表达明显降低、Foxp3 蛋

白表达明显升高（P＜0.01）。结果见表4、图2和图3。—

5 讨论

PM2.5 指空气动力学直径≤2.5 μm的颗粒物，是雾霾的重要组成部分。近年流行病学研究显示，大气中 PM2.5 浓度升高与呼吸系统疾病的病死率关系密

切[2-7]。

TH17/Treg免疫平衡是机体除TH1/TH2之外的又一重要的免疫机制，其免疫失衡与气道炎症、气道黏液高分泌及气道重构均密切相关。PM2.5 可导致

TH17/Treg 失衡。有研究表明，PM2.5 引起小鼠 BALF

IL-17 显著升高， IL-10 显著降低，肺组织 RORγt mRNA 表达升高，Foxp3 mRNA 表达降低[8]，从而直接参与了 TH17/Treg 免疫失衡。PM2.5还可通过多种途径诱发 TH17/Treg 免疫失衡。有研究表明，PM2.5可使小鼠 IL-6 及转化生长因子-β 升高[9]。PM2.5 可明显抑制人胚肺细胞 IL-2 的生成[10]，这一结果在大鼠

动物实验中也得到证实[11]。TGF-β 和 IL-6 可通过诱导大量的RORγt表达进而启动RORγt信号转导通路，从而促进 Th17 细胞的分化。TGF-β 和 IL-6 还可诱导RORa 的表达，此过程依赖于 STAT3。过高表达的RORa 可通过诱导 IL-17 和 IL-17F 来促进 Th17 细胞的分化，而 RORa缺陷时则可导致体内外 IL-17 明显减少。RORγt 和 RORa 两者共存可协同促进 Th17 细胞的表达。Laurence A 等[12]研究发现，IL-2 可以通过

STAT5 抑制 RORγt 活性抑制 Th17 细胞的分化。玉屏风散由黄芪、白术及防风组成。黄芪味甘性温，归肺、脾经，益气固表；白术味甘、苦，性温，归肺、脾经，可益气健脾止汗；防风味辛、甘，性温，归膀胱、肝、脾经，可解表祛风。本方配伍严谨，补中寓疏，散中寓补，具有固表而不留邪、祛邪而不伤正的特点。临床和实验研究显示，本方对呼吸系统损

伤有很好的干预作用[13-16]。过敏煎（祝谌予方）由银柴胡、防风、乌梅、五味子组成。银柴胡味甘性微寒，归肝、胃经，可清热凉血；乌梅味酸、涩性平，归肝、脾、肺、大肠经，五味子味酸甘性温，归肺，心、肾经，两药配合，敛肺益气生津；防风味辛甘性温，归膀胱、肝、脾经，功能抗过敏。本方组方严谨，寒热共济，有收有散。

止嗽散源于清代程国彭所著《医学心悟》，方由桔梗、荆芥、紫菀、百部、白前、甘草、陈皮组成。方中紫菀、百部为君，其性温而不热，润而不寒，皆可止咳化痰，新久咳嗽都能使用；桔梗味苦辛，善于开宣肺气，白前味辛甘，长于降气化痰，两者协同，一宣一降，以复肺气之宣降，为臣药；荆芥、陈皮为佐药，荆芥辛而微温，疏风解表利咽，以除在表之余邪，陈皮理气化痰；甘草缓急和中，调和诸药之升降收散，合桔梗、荆芥又有利咽止咳之功，是佐使之用。本方具有温而不燥、润而不腻、散寒不助热、解表不伤正的特点，故对新久咳嗽、咳痰不爽者，加减运用得宜，均可获效。过敏煎合止嗽散加强了祛风理肺之力，止嗽散合过敏煎则熄风理肺之力更强。两方合用，疏风解表宣肺，理气化痰止咳，治疗咳嗽属风邪犯肺，疗效明显。临床和实验研究均显示，两方对多种肺系疾

病均有较好的治疗作用[17-20]。

本实验结果显示，PM2.5 可导致大鼠 Th17/Treg失衡，引发肺组织损伤，玉屏风散及过敏煎合止嗽散均可改善 PM2.5致大鼠肺组织病理损害；降低PM2.5导致的血清及BALF 中 IL-8、IL-17、NE 含量，升高

IL-10 含量。同时可降低肺组织 IL-17 的蛋白表达，上调 Foxp3 的蛋白表达，进而对 PM2.5 致肺损伤起到保护作用。

结合玉屏风散及过敏煎合止嗽散方义，前者可能偏于调节机体免疫功能、提高机体免疫力，后者抗炎、抗过敏作用更明显。玉屏风散更适合预防性给药，后续研究将在本实验研究结果的基础上，分时段给药，分时段取材，选取针对免疫应答及炎症反应的效应指标，进一步比较研究两者改善PM2.5 致肺损伤的具体机制、作用靶点及最佳干预时机。

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