消痰和胃方对胃癌前病变大鼠细胞凋亡的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - Chinese Journal Of Information On Traditional Chin -

张璇,徐晶钰,孙大志,秦志丰,李勇进,施俊,唐继贵,张映城,魏品康

第二军医大学长征医院中医科,上海 200003

摘要:目的 观察消痰和胃方对胃癌前病变大鼠胃黏膜细胞 Caspase-3 表达及凋亡指数的影响,探讨该方干预胃癌前病变的机制。方法 采用化学干预为主的多因素造模法制作胃癌前病变大鼠模型。实验大鼠随机分为正常组、模型组、维酶素组、消痰和胃方组,各组给予相应药物灌胃。干预6周后,免疫组化检测大鼠胃黏膜细胞 Caspase-3 的表达,TUNEL 法检测大鼠胃黏膜细胞凋亡指数。结果 与正常组比较,模型组胃黏膜细胞 Caspase-3 水平和凋亡指数明显降低(P<0.05);与模型组比较,消痰和胃组和维酶素组胃黏膜细胞 Caspase-3

水平和凋亡指数明显升高(P<0.05),且消痰和胃组明显优于维酶素组(P<0.05)。结论 消痰和胃方可能通过上调 Caspase-3的表达促进胃癌前病变细胞凋亡,从而达到防治胃癌前病变的作用。

关键词:胃癌前病变;消痰和胃方;凋亡指数;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3;大鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.014

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)04-0054-03

Effects of Xiaotan Hewei Formula on Cell Apoptosis of Precancerous Lesions of Gastric Carcinoma Rats

ZHANG Xuan, XU Jing-yu, SUN Da-zhi, QIN Zhi-feng, LI Yong-jin, SHI Jun, TANG Ji-gui, ZHANG Ying-cheng, WEI Pin-kang (Department of Traditional Chinese Medicine, Changzheng Hospital Affiliated to Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)

Abstract: Objective To investigate the effects of Xiaotan Hewei Formula on the Caspase-3 expression and apoptosis index of precancerous lesions of gastric (PLGC) rats; To explore potential mechanism of intervention on PLGC. Methods The rat model of gastric precancerous lesion was made by multi-factor modeling with chemical intervention primarily. The rats were randomly divided into normal group, model group, Vimentin group, Xiaotan Hewei Formula group. Each administration group was given the corresponding medicine for gavage. After 6 weeks of intervention, the expression of Caspase-3 in gastric mucosa was detected by immunohistochemistry. The apoptosis index of gastric mucosa was detected by TUNEL method. Results Compared with the normal group, the level of Caspase-3 and the apoptosis index of gastric mucosa cells in the model group were significantly lower (P<0.05); Compared with the model group, the level of Caspase-3 and the apoptosis index of gastric mucosa cells in the Xiaotan Hewei Formula group and Vimentin group increased significantly (P<0.05), and the Xiaotan Hewei Formula group was better than Vimentin group (P<0.05). Conclusion Xiaotan Hewei Formula can promote the apoptosis of PLGC by upregulating the expression of Caspase-3, which can prevent gastric precancerous lesion.

Key words: precancerous lesions of gastric carcinoma; Xiaotan Hewei Formula; apoptosis index; Caspase-3; rats

胃癌是常见的恶性肿瘤,严重威胁人类的生存,其发病率及死亡率较高。胃癌前病变(precancerous lesions of gastric carcinoma,PLGC)的防治是胃癌二级预防的重要内容[1]。逆转 PLGC成为了胃癌防治的有效措施之一。目前西医治疗PLGC的特殊药物及手段并不完善,而中医药的优势则较为明显,不仅能改

基金项目:国家自然科学基金(81202678);第二军医大学

青年启动基金(2012QN17)

通讯作者:徐晶钰,E-mail:jyxu1983@163.com 善患者的临床症状,还可逆转 PLGC[2]。因此,中医药防治 PLGC已逐渐受到业界的重视,其中胃黏膜细胞凋亡紊乱在PLGC的发生发展中扮演了重要角色。消痰和胃方是我院临床经验方。本研究观察消痰和胃方对 PLGC 大鼠胃黏膜细胞 Caspase-3 水平及凋亡指数的影响,初步探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

清洁级 Wistar 雄性大鼠,6周龄,中国科学院上海试验动物中心,动物许可证号 SCXK(沪)2012-

0002。饲养于第二军医大学药学院清洁级开放式动物房。

1.2 药物

消痰和胃方,方中饮片均购自上海雷允上中药饮片公司,第二军医大学附属长征医院制剂室水提醇沉制成浸膏;维酶素片,新乡恒久远药业有限公司,批号 20120102;N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG),日本东京化成工业株式会社。

1.3 主要试剂与仪器

水合氯醛、伊红染液、10%中性福尔马林固定液、梯度乙醇及二甲苯,第二军医大学药学院;鼠抗人

Caspase-3 单克隆抗体,英国 Abcam 公司;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司。电子秤,寺冈电子有限公司;石蜡切片机,德国Leica 公司;光学显微镜,日本 Olympus 公司;高温烘烤箱,德国 Heraens 公司;高速冷冻离心机,德国Kendro实验仪器公司;低温冰箱,海尔公司;紫外分光光度计,上海谱元仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 造模

参照文献[3]方法并加以改进。300 μg/mL MNNG

溶液灌胃,同时予无水乙醇灌胃,3 d 灌胃 1 次,进食 2d 后禁食1d。夹尾时间为每周三 9:00,保持大鼠争夺激怒状态10 min,连续 32周。胃黏膜组织病理

学改变判断标准参照文献[4]。

2.2 分组和给药

成模大鼠随机分为模型组、维酶素组、消痰和胃组,分别为 11、13、14 只。另取 14只大鼠作为正常组。根据人和动物体表面积折算等效剂量比值简表进行人口服中药剂量与鼠灌胃中药剂量换算,得出各组大鼠所需灌胃剂量。正常组和模型组给予生理盐水灌胃,维酶素组给予维酶素悬浊液灌胃,消痰和胃组给予消痰和胃方浸膏灌胃。给药体积均为1 mL/100g 体质量,每日1次,连续6周。

2.3 标本收集

6周后,所有大鼠禁食不禁水24 h,水合氯醛腹腔注射麻醉,剑突下沿腹中线剪开,将胃部与周围组织分离,沿胃大弯纵向切开,去除胃内容物,取胃大弯处胃黏膜组织,福尔马林固定,常规石蜡包埋,切片。

2.4 免疫组化检测 Caspase-3 表达

将石蜡切片置于 60 ℃烤箱烘干过夜;3%H2O2室温孵育,将内源性过氧化物酶灭活;微波修复抗原;加入稀释的抗 Caspase-3 抗体及生物素标记的二抗, 室温孵育,PBS反复冲洗;加入用辣根酶标记的链霉卵白素,室温孵育;DAB 显色;苏木素衬染,0.1%盐酸酒精分化,自来水反复冲洗至返回蓝色;常规脱水,透明,中性树胶封片。免疫组化积分标准:按阳性细胞所占百分比计 0 分(<5%)、1 分(5%~

25%)、2 分(26%~50%)、3 分(51%~75%)、4分

(>75%),再按染色强度计 0 分(无色)、1 分(淡

黄色)、2 分(棕黄色)、3分(棕褐色),二者相乘为积分结果。记录各组分值并统计阳性表达细胞数,计算积分均数。

2.5 TUNEL 法检测细胞凋亡

采用 TUNEL 法检测常规处理的胃标本石蜡切片,实验步骤按照试剂盒说明严格执行。凋亡细胞的

判断标准为细胞核中出现棕黄色颗粒,5 个高倍镜下

细胞个数均>1000,统计凋亡细胞数和总细胞数。计算凋亡指数(AI)。AI(%)=凋亡细胞数÷总细胞

数×100%。

3 统计学方法

采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s 表示,多组间比较采用方差分析,组间比较采用—

LSD-t检验,等级资料多组间比较用非参数秩和K-W检验,分组比较采用 WILCOXON 秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果 4.1 消痰和胃方对模型大鼠胃黏膜细胞 Caspase-3蛋白表达的影响

与正常组比较,模型组 Caspase-3 水平明显降低

(P<0.05);与模型组比较,消痰和胃组和维酶素组

Caspase-3 水平明显升高(P<0.05),且消痰和胃组优

于维酶素组(P<0.05)。结果见表 1、图 1。

4.2 消痰和胃方对模型大鼠胃黏膜细胞凋亡指数的影响

与正常组比较,模型组AI值明显降低(P<0.05);与模型组比较,消痰和胃组和维酶素组 AI 值明显升高(P<0.05),且消痰和胃组优于维酶素组(P<0.05)。结果见表2、图 2。

5 讨论

PLGC是指一类胃黏膜的病理学改变,与胃癌密切相关。同时也是胃黏膜在多种致癌诱因作用下向胃癌演变过程中的一个重要阶段。此阶段的标志通常是胃黏膜细胞出现异型增生,成为胃癌发生的重要组织

病理学基础[5]。凋亡作为细胞程序性死亡的重要方式,其介导和执行作用是通过 Caspase 家族实现的。目前研究显示,

Caspase-3 作为家族中最重要的凋亡执行者,是细胞凋亡的关键酶,它在众多凋亡信号传导途径中起着重

要作用[6]。Caspase-3 同时也是多种凋亡信号汇集的终

点,它的活化表明凋亡不可逆转[7]。我院魏品康教授提出“痰”是PLGC 的核心病机

思想[8]。宏观上痰湿内壅,困阻中焦脾胃,出现饱胀纳差、呕恶疼痛等症状,病程缠绵、反复难愈;微观上各种致病因素导致的病理产物可归于中医痰浊范畴,痰浊浸淫胃黏膜细胞,诱导细胞恶变,逐渐成为

胃癌细胞[9]。因此,阻断 PLGC的进程,可以预防胃癌的发生,这也是中医“治未病”思想的具体体现。

消痰和胃方由柴胡、制半夏、茯苓、黄连、白花蛇舌草、蒲公英、桂枝、制大黄、白芍、炙甘草等组

成[10]。方中柴胡、制半夏相伍,共为君药,苦辛温燥,痰气并治;臣以茯苓、黄连、白花蛇舌草、蒲公英,健脾祛湿、清热解毒;桂枝温通经脉,制大黄通闭逐瘀,共为佐药;炙甘草与白芍酸柔甘守,化生胃阴为使。

本实验采用以化学损伤为主的多因素方法建立PLGC 大鼠模型,结果表明消痰和胃方可提高 PLGC大鼠胃黏膜细胞 Caspase-3 表达和凋亡指数,促进细胞凋亡,恢复增殖与凋亡的动态平衡,起到逆转PLGC胃黏膜病理状态,防止向胃癌的进一步演变的作用。

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(收稿日期:2016-06-17)

(修回日期:2016-07-12;编辑:华强)

维酶素组 各组大鼠胃黏膜细胞

表 2各组大鼠胃黏膜细胞凋亡指数比较(x±s,%)

消痰和胃组 各组大鼠胃黏膜细胞凋亡形态(TUNEL染色,×400)

消痰和胃组 Caspase-3 蛋白表达(免疫组化染色,×400)

2 维酶素组

正常组

模型组

正常组

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