CJI (Traditional Chinese Medicine)
红芪多糖对模型小鼠糖尿病心肌病心肌纤维化和基质金属蛋白酶2及其抑制剂表达的影响
王东旭，金智生，张花治，和彩玲，南向萍，石桂珍，楚惠媛
甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000
摘要：目的 观察红芪多糖（HPS）对模型小鼠心肌组织基质金属蛋白酶 2（MMP-2）及其抑制剂（TIMP-2）表达的影响，探讨其防治糖尿病心肌病心肌纤维化的作用机制。方法 将 60只实验小鼠随机分为模型组、罗格列酮组和HPS高、中、低剂量组，正常组为12只同周龄同背景的非转基因雄性 BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju小鼠。各组给予相应药物灌胃，连续8周。给药前及给药2、4、6、8 周末检测小鼠血糖；Masson染色观察心肌纤维化程度；蛋白印迹法检测心肌组织 MMP-2、TIMP-2 的蛋白表达。结果 与模型组比较，HPS高、中剂量组和罗格列酮组小鼠血糖明显下降。Masson 染色结果显示，模型组小鼠心肌间质中亮绿色纤维较正常组明显增多，HPS 高剂量组、罗格列酮组较模型组有所减少。蛋白质印迹检测结果显示，与正常组比较，模型组小鼠 MMP-2 表达明显降低，TIMP-2 表达明显升高，MMP-2/TIMP-2 比值下降；与模型组比较，HPS 高、中剂量组和罗格列酮组小鼠MMP-2 表达明显升高，TIMP-2 表达明显降低，MMP-2/TIMP-2 比值上升。结论 HPS可减轻模型小鼠糖尿病心肌病心肌纤维化程度，其治疗作用可能是通过升高 MMP-2/TIMP-2 比值，从而使模型小鼠心肌纤维化有所减轻。
关键词：糖尿病心肌病；红芪多糖；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶组织抑制因子-2；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2017)04-0057-04
Effects of HPS on Myocardial Fibrosis and Expression of MMP-2/TIMP-2 in Model Mice of Diabetic Cardiomyopathy
WANG Dong-xv, JIN Zhi-sheng, ZHANG Hua-zhi, HE Cai-ling, NAN Xiang-ping, SHI Gui-zhen, CHU Hui-yuan (Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)
Abstract: Objective To observe the effects of hedysari polysaccharide (HPS) on myocardial fibrosis and the expression of MMP-2/TIMP-2 in model mice of diabetic cardiomyopathy; To discuss the mechanism of action of prevention and treatment of myocardial fibrosis in diabetes. Methods Sixty mice were randomly divided into model group, rosiglitazone group and HPS high-, mediume- and low-dose groups. The normal group was 12 non-transgenic male BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju mice with the same age. Each group was given relevant medicine for gavage, for
8 weeks. Blood glucose of mice before and after medication 2, 4, 6, and 8 weeks was detected. The levels of MMP-2,
MMP-2 and MMP-9 in myocardium were measured by Masson staining. The protein expressions of MMP-2 and TIMP-1 in myocardium were detected by Western blot. Results Compared with the model group, the blood glucose of HPS (highand medium dose) groups and rosiglitazone group decreased significantly. Masson staining showed that the green fibers in the model group significantly increased and rosiglitazone group and HPS high-dose group decreased compared with the model group. Western blot showed that the expressions of MMP-2 in model group and MMP-2/TIMP-2 ratio were declined significantly, while the expression of MMP-2 was increased and TIMP-2 was decreased significantly, and the ratio of MMP-2/TIMP-2 increased in rosiglitazone group and HPS high- and medium-dose group. Conclusion HPS may reduce the degree of myocardial fibrosis in model mice with diabetic cardiomyopathy. The therapeutic effect of HPS may be to relieve myocardial fibrosis in model mice by increasing the ratio of MMP-2/TIMP-2.
Key words: diabetic cardiomyopathy; hedysari polysaccharide; MMP-2; TIMP-2; mice
基金项目：国家自然科学基金（81360538）
通讯作者：金智生，E-mail：jzsgszy@126.com
糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）作为糖尿病（diabetes mellitus，DM）状态下一种独立的心血管病变，最终可演变为充血性心力衰竭，甚者可发生猝死，是 DM 患者死亡的主要原因之一。DCM 具体的发病机制至今仍未完全阐明，但有研究表明，DCM 心肌纤维化的发生发展与基质金属蛋白酶 2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）及其抑制剂（tissue inhibitors of matrix metalloproteinases-2，
[1]
TIMP-2 ）的调控紊乱密切相关 。本实验以
BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju 小鼠为研究对象，观察红芪多糖（hedysari polysaccharide，HPS）对模型小鼠心肌组织 MMP-2、TIMP-2 蛋白表达的影响，探讨其在 DCM过程中防治心肌纤维化中的可能作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
雄性 SPF 级 BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju 小鼠
60 只，6 周龄，体质量（30.83±2.28）g；雄性 SPF级 BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju 小鼠 12 只，6 周龄，
体质量（18.02±1.49）g，均由南京大学模型动物研究所提供，动物许可证号 SCXK（苏）2015-0001。分笼饲养于甘肃中医药大学 SPF 级动物实验室，光照
12 h 明暗交替，温度（22±1）℃、湿度（55±5）%，自由饮食饮水。
1.2 药物
HPS由甘肃中医药大学药学院负责提取，纯度为87.44%；罗格列酮片，太极集团重庆涪陵制药有限公司，批号 14120060。
1.3 试剂
Masson 染色试剂，兰州大学基础医学院病理学研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号 20150910）、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（批号 20160314），北京索莱宝有限公司；山羊抗兔 MMP-2 单克隆抗体（批号 GR213052-23）、山羊抗兔 TIMP-2 多克隆抗体（批号 GR180886-1），英国 Abcam 公司；GAPDH（批号
ZS-257780 ）、山羊抗兔 IgG/辣根酶标记（批号
ZB-2301），北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL显色试剂（批号 1414301），美国 Millipore 公司。
1.4 仪器
罗氏血糖仪（卓越精采型），Roche 公司；CT14RD台式高速冷冻离心机，上海天美生化仪器设备有限公
司；DNM-9602酶标分析仪，北京普朗新技术有限公
司；STS-D5 磁力搅拌器，德国IKA 公司；PowerPoc Basic 凝胶电泳仪，美国 Bio-rad 公司；ChemiDocTM
XRS+凝胶成像分析仪，美国 Bio-rad 公司。
2 实验方法
2.1 分组与给药
60只实验小鼠适应性喂养1周后，按照体质量采用随机数字表法分为模型组、罗格列酮组和HPS 高、中、低剂量组，每组 12 只。HPS 高、中、低剂量组分别给予 200、100、50 mg/（kg•d）HPS 灌胃，HPS
用蒸馏水稀释，按体质量予同浓度（20 mg/mL）药物；罗格列酮组予罗格列酮4 mg/（kg•d）灌胃。模型组和正常组（同周龄同背景非转基因小鼠 12 只）均予
生理盐水（0.2 mL/d）灌胃。分组后各组小鼠均予标准饲料喂养，每 2 周测空腹血糖 1 次，连续 8 周。8周实验结束时共剩余小鼠66只，分别为正常组12只、模型组 10只、罗格列酮组11 只和 HPS 高、中、低剂量组 12、11、10 只。
2.2 标本采集与处理
干预第8周末禁食、不禁水12 h后称重，心脏取
血，3000 r/min 离心 10 min，取上层血清，-20 ℃保存。心脏取血后处死小鼠，取出心脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，剪除包膜、血管及心房组织，留取左
室心肌组织、光镜标本后，置于-80 ℃冰箱保存备用。
2.3 指标检测
2.3.1 血糖 分别于给药前及给药2、4、6、8 周末尾静脉取血，检测各组小鼠空腹血糖。
2.3.2 Masson 染色 取各组小鼠左室心肌组织，在
4%多聚甲醛溶液中固定、石蜡包埋、切片,进行Masson染色，观察各组小鼠心肌纤维化程度。
2.3.3 基质金属蛋白酶 2 及其抑制剂表达检测 称取左室心肌组织50 mg，按试剂盒说明提取蛋白，测蛋白浓度后，蛋白变性。每样品孔上样40 μg 总蛋白，行 SDS-PAGE 电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h。分别加入 MMP-2 一抗（稀释度为 1∶500）、TIMP-2 一抗（稀释度为 1∶500）和 GAPDH 一抗（稀释度为1∶
1000），4 ℃过夜。TBST洗膜 10 min×3 次，将膜置于山羊抗兔辣根酶标记的二抗中（稀释度为 1∶
5000），室温孵育 90 min，TBST 洗膜 10 min×3 次。ECL化学发光液显影后，用凝胶成像分析仪采集信号并摄像。Western blot 图像用 Image J分析软件对各组条带进行分析，将各组整合灰度值与内参（GAPDH）比较（目的蛋白 ID/内参 ID）即得 MMP-2、TIMP-2的相对表达量。
3 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s 表示，组间比较采用方差分析，多组间比较采用—
LSD 检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 红芪多糖对模型小鼠血糖的影响
与正常组比较，模型组小鼠血糖明显升高，差异
4.2 红芪多糖对模型小鼠心肌纤维化程度的影响
正常组小鼠心肌间质及血管周围可见少量亮绿色胶原纤维；模型组小鼠心肌间质、血管周围亮绿色胶原纤维明显增多且排列紊乱；HPS高剂量组、罗格列酮组小鼠心肌间质亮绿色胶原纤维较模型组明显减少。结果见图1。
4.3 红芪多糖对模型小鼠心肌组织基质金属蛋白酶2及其抑制剂蛋白表达的影响
与正常组比较，模型组 MMP-2 蛋白表达明显降
低，TIMP-2 蛋白表达明显升高，MMP-2/TIMP-2 比值
明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，罗格列酮组和 HPS 高、中剂量组 MMP-2 蛋白表达明显升高， TIMP-2 蛋白表达明显降低，
有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，各干预组血糖均有所下降，罗格列酮组和 HPS 高、中剂量组
明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表1。—
MMP-2/TIMP-2 比值明显上升，差异有统计学意义
（P＜0.05）。结果见图 2、图 3。 注：A.正常组；B.HPS 高剂量组；C.HPS中剂量组； D.HPS 低剂量组；E.罗格列酮组；F.模型组； 与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05
5 讨论
DCM 作为一种特异性的心血管病变，早期主要以左室舒张功能异常为主，晚期则表现为左室收缩功
能障碍[2-3]，最终可引起心肌广泛灶性坏死。其主要病理改变包括心肌细胞外基质堆积、心肌肥厚及心肌
间质纤维化[4]。其中，心肌间质纤维化可导致心脏顺应性降低，进而引起心脏收缩及舒张功能障碍。本实验 Masson 染色结果显示，与正常组比较，模型组心肌间质及血管周围的亮绿色胶原纤维明显增多且排列紊乱，胶原沉积现象明显，表明模型组小鼠心肌组织存在明显的心肌纤维化。
有研究发现，基质金属蛋白酶家族（MMPs）/基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）的调控紊乱与DCM
的发生发展密切相关[5]。MMPs 能有效降解心肌细胞外基质，其中 MMP-2 在心肌组织中表达水平较高，
是抗心肌纤维化的主要成分[6]。TIMPs 能通过其 N末端的功能区与 MMPs 催化活性中心的锌离子发生特异性结合，从而使有活性的MMPs失活或避免无活性的 MMPs 激活[7]。TIMP-2 作为 MMP-2 的天然抑制物，也存在于心肌组织中，可通过结合相应的MMP-2而影响心肌组织的活性，二者的平衡对维持心肌组织
正常的胶原代谢意义重大[8]。
HPS是甘肃道地药材红芪的提取物，主要有减轻
胰岛素抵抗[9]、调节免疫[10]等作用。课题组前期实验研究表明，HPS可通过调节模型小鼠肾脏组织血管内皮生长因子、色素上皮细胞衍生因子蛋白和 mRNA的表达，改善糖尿病微血管病变，减轻糖尿病肾病病理状态，从而起到防治糖尿病肾病肾间质纤维化发生
发展的作用[11]。本实验结果显示，HPS高剂量组血糖
较模型组明显降低（P＜0.05），提示 HPS可改善模型小鼠的血糖代谢水平；本实验同时发现，模型小鼠存在广泛的心肌纤维化，经 HPS 干预治疗后，HPS 高剂量组小鼠心肌细胞周围亮绿色胶原纤维较模型组明显减少，同时心肌组织 MMP-2 的表达量较模型组
明显上调，TIMP-2 的表达量较模型组明显下调，
MMP-2/TIMP-2 比值较模型组明显升高。这些结果均表明 HPS 可减轻DCM模型小鼠的心肌纤维化程度， 其治疗作用可能是通过升高 MMP-2/TIMP-2 比值，使其趋于相对平衡，从而起到降解心肌细胞外基质，改善心肌组织活性，防治心肌纤维化的作用。
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（收稿日期：2016-05-25）
（修回日期：2016-06-21；编辑：华强）