芫花醇提物对不同种属体系UGTs及UGT1A1活性的影响

2017-04-15 -

郭嫦娥，苗培培，陈红影，陈宁，马鹏凯，李红品，朱虹宇，高兴，张玉杰

北京中医药大学中药学院，北京 100102

摘要：目的考察芫花醇提物对UGTs 及 UGT1A1活性的影响，为阐释芫花毒性机制提供依据。方法采用体外肝微粒体孵育模型，以4-硝基酚为底物检测 UGTs 活性，以β-雌二醇为底物检测 UGT1A1 活性，利用UV和 HPLC 测定底物及代谢物含量。结果芫花醇提物中 3 种黄酮类成分芹菜素、羟基芫花素、芫花素含量分别为 6.34%、8.72%、6.06%，UV 测得总二萜含量为 31.40%。体外实验表明，在大鼠肝微粒体（RLM）和人肝微粒（HLM）孵育体系中，芫花醇提物均能显著抑制 UGTs 活性；对 UGT1A1 活性，在 RLM、HLM 和重

组酶（rhUGT1A1）孵育体系中，芫花醇提物均表现为中等强度的抑制作用，以羟基芫花素计，半数抑制浓度分别为 46.32、32.49、8.382 mol/L，抑制类型分别为竞争性抑制作用、反竞争性抑制作用和竞争性抑制作用。结论芫花醇提物对不同肝微粒体孵育体系中 UGTs 及 UGT1A1 活性均可产生抑制作用且存在种属差异性，这种抑制作用可能是芫花致肝损伤的机制之一。

关键词：芫花；醇提物；UGTs；UGT1A1；肝微粒体；毒性；抑制作用

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.021

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2017)04-0083-05

Effects of Genkwa Flos Ethanol Extracts on UGTs and UGT1A1 Activities in Different Systems

GUO Chang-e, MIAO Pei-pei, CHEN Hong-ying, CHEN Ning, MA Peng-kai, LI Hong-pin, ZHU Hong-yu, GAO Xing, ZHANG Yu-jie (School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing

100102, China)

Abstract: Objective To investigate the inhibition of Genkwa Flos ethanol extracts on UGTs and UGT1A1 activities of different liver microsomes; To predict the toxicity mechanism of Genkwa Flos. Methods By adopting in vitro liver microsomes incubation model, 4-nitrophenol (4-NP) and β-estradiol were selected as substrates to determine activities of UGTs and UGT1A1 by UV and HPLC, respectively. Results Content determination results show that there were 6.34% of apigenin, 8.72% of hydroxygenkwanin and 6.06% of genkwanin in ethanol extracts, and total diterpene accounted for 31.40%. In vitro research showed that ethanol extracts significantly inhibited UGTs activity in rat and human liver microsome. UGT1A1 activity was inhibited by hydroxygenkwanin with IC50 about

46.32, 32.49 and 8.382 mol/L in rat liver microsome (RLM), human liver microsome (HLM) and recombinant

UGT1A1 (rhUGT1A1), respectively. The inhibition types were competitive inhibition in RLM and rhUGT1A1, and uncompetitive inhibition in HLM. Conclusion Ethanol extracts showed different inhibition of UGTs and UGT1A1 activities, and the inhibition may reveal one of the mechanisms of liver injury induced by Genkwa Flos.

Key words: Genkwa Flos; ethanol extracts; UGTs; UGT1A1; liver microsomes; toxicity; inhibition

芫花 Genkwa Flos 为瑞香科植物 Daphne genkwa Sieb. et Zucc.的干燥花蕾，其性温，味苦、辛，归肺、脾、肾经[1]，为传统峻下逐水药[2]。芫花含有黄酮类、香豆素类、木脂素类、二萜原酸酯类、挥发油类等多

基金项目：国家自然科学基金（81274177、81073140）；北京

中医药大学自主选题项目（2016-JYB-XS048、2016-JYB-XS081、

2016-JYB-XS058）

通讯作者：张玉杰，E-mail：zhyj227@126.com

种化学成分[3]，具有镇咳、祛痰、镇痛、抑菌、抗炎、

抗惊厥、抗肿瘤等多种药理活性[4]，但长期大剂量使

用可致肝、肾、脑等器官出现严重损伤[5]，并对皮肤

及黏膜具有严重的刺激性[6]。研究表明，芫花醇提物

是芫花的主要活性部位，具有良好的镇痛作用[7]、抗

炎活性[8]、抗寄生虫活性[9]，同时也具有明显的肝肠

毒性作用[10]。UGTs 催化的葡萄糖醛酸结合反应是体内重要的Ⅱ相代谢途径，可增加底物的亲水性，使其更有效地从尿或胆汁中排出体外，对调节机体与外环

境间的相互作用和保持机体内环境的稳定具有重要

意义[11-12]。UGT1A1 是葡萄糖醛酸转移酶中重要的一员，是许多内源性激素、毒性代谢物（如胆红素）和

外源物的结合酶[13]，对维持体内平衡具有重要的作用。因此，研究基于UGTs介导的药物相互作用对解释中药配伍原理及指导临床用药具有重要意义。曾有报道芫花对细胞色素 P450 酶活性的影响[14]，而其对Ⅱ相代谢酶 UGTs活性的影响研究目前尚未见报道。本试验采用肝微粒体体外孵育方法，以 4-硝基酚

（4-NP）和β-雌二醇为探针底物，利用UV 和 HPLC分别测定底物及代谢产物的含量变化，考察芫花醇提物对人和鼠肝微粒体孵育体系中UGTs及UGT1A1活性的影响，为芫花致肝损伤的可能机理、芫花的开发利用，以及预测临床可能的代谢性药物相互作用提供依据。

1 仪器与试药

岛津高效液相色谱仪（LC-20AT 四元高压泵，

SPD-20A UV-vis 检测器，DGO-20A在线真空脱气机，

SIL-20A 自动进样器，GTO-10AS VP柱温箱及LC 色

谱工作站），T10 basic 匀浆器（IKA，德国），TGL 20M台式高速冷冻离心机（长沙湘智离心机仪器有限公

司），TU-1901 紫外分光光度计（北京普析通用仪器

有限责任公司），DKZ-450B 型电热恒温振荡水槽（上海森信实验仪器有限公司），VOTEX GENIVS 漩涡混

匀仪（IKA），MTN-2800D 型氮气吹干仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

芫花（批号 14010602），安徽本草国药有限公司，经北京中医药大学中药学院张贵君教授鉴定为瑞香科植物芫花 Daphne genkwa Sieb. et Zucc.的干燥花蕾；芫花素、芹菜素（批号分别为 111899-201202、

111901-201102，纯度均≥98%）、氢溴酸右美沙芬（批号 100201-201003，纯度≥98%），中国食品药品检定研究院；羟基芫花素（批号 10540000，纯度≥98%），上海标准品生物技术有限责任公司；丙甲菌素，北京拜耳迪生物技术有限公司（J&K Scientific，中国大

陆）；尿苷-5'-二磷酸三钠盐（UDPGA）、D-葡萄糖二

酸-1,4-内酯，Sigma-Aldrich；混合雄性大鼠肝微粒体（RLM）、男性混合人肝微粒体（HLM），汇智泰康生物技术（北京）有限公司；重组酶 UGT1A1

（rhUGT1A1），BD 公司（上海，中国）；脱水穿心莲内酯（批号 A0473，纯度≥98%），成都曼思特生物科技有限公司；β-雌二醇，TCI 公司；β-雌二醇-3-葡糖

醛酸苷（E-3-G），Toronto Research Chemicals Inc.；

4-NP，上海江莱生物科技有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，美国 Fisher公司；其余试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 芫花醇提物的制备

称取芫花1 kg，用 10 倍量95%乙醇加热回流提取2h，得提取液；残渣用50%乙醇继续加热回流提取 2 h，合并提取液，减压浓缩，蒸干，得芫花醇提取物 164.12 g。

2.2 芫花醇提物主要成分含量测定

2.2.1 HPLC测定3种黄酮成分采用Agilent Zorbax

Extend-C18 色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 m），流动相A为 0.2%甲酸水、B 为乙腈，梯度洗脱（0～25 min，

90%～80%A；25～60 min，80%～48%A；60～70 min，

48%～10%A；70～80 min，10%～90%A），流速为

1 mL/min，柱温 40 ℃，检测波长 280 nm[15]。3 种黄酮成分分离良好，芫花素、羟基芫花素、芹菜素保留时间分别为 54.25、48.68、41.78 min。色谱图见图 1。

2.2.2 比色法测定总二萜含量选择与芫花中二萜类成分结构相似的脱水穿心莲内酯作为对照品，测定

芫花醇提物中总二萜含量[16]。取脱水穿心莲内酯对照品及芫花醇提物溶液各2 mL，分别置于 10 mL具塞试管中，水浴挥干溶剂，分别加入新鲜配制的 5%香草醛-冰乙酸溶液 0.2 mL及高氯酸 0.8 mL，混匀，密塞，置 60 ℃水浴中反应15 min，取出，迅速冷却后精密加入冰乙酸5 mL，混匀，静置 10 min，以空白试剂作为对照，于400～800 nm波长处测定吸收光谱，结果见图2、图 3。选择 410 nm为检测波长，测定芫花醇提物中总二萜含量。

2.3 HPLC 测定 UGT1A1 活性

采用 Agilent Zorbax Extend-C18 色谱柱（4.6 mm×

150 mm，5 m），流动相 A为 0.2%甲酸水、B 为乙

腈，梯度洗脱（0～10 min，90%～75%A；10～30 min，

75%～48%A；30～45 min，48%～10%A，45～60 min，

10%～90%A），流速 1 mL/min，柱温 40 ℃，检测波长 280 nm。结果 UGT1A1 底物β-雌二醇的代谢产物

E-3-G 与内标（氢溴酸右美沙芬）峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰，空白肝微粒体及提取物成分对测定无干扰，专属性强。色谱图见图4。

2.4 温孵条件及样品处理

2.4.1 UGTs 活性测定参照文献[17-19]方法，以

4-NP 为底物，采用UV 进行测定。200 L 温孵体系包括 0.2 g/L RLM 或 HLM、丙甲菌素（50 g/mg

protein）、3 mmol/L UDPGA、100 mmol/L Tris-HCl、

5 mmol/L MgCl2、5 mmol/L D-葡萄糖二酸-1,4-内酯、

1 mmol/L 4-NP 及 100 mol/L 芫花醇提物（以羟基芫

花素计）。37 ℃预孵育5 min，加入 UDPGA 启动反应，孵育 30 min，加入 5%三氯乙酸 2 mL终止反应，

13 000×g 离心 15 min，取上清液 1 mL，加入 2 mol/L NaOH 0.25 mL，于 405 nm波长处测定吸光度。

2.4.2 UGT1A1 活性测定参照苗培培等[18]方法，确定温孵时间为30 min，蛋白终浓度为 0.5 g/L。

2.5 芫花醇提物对 UGT1A1 的半数抑制浓度测定

取 UGT1A1 的特异性底物 β-雌二醇，测定不同浓度芫花醇提物作为抑制剂对其代谢的抑制作用，计

算半数抑制浓度（IC50）。在孵育体系中，固定探针底

物浓度不变（RLM：35 mol/L；HLM 和 rhUGT1A1：

30 mol/L），芫花醇提物的浓度（以羟基芫花素计）为 0～150 mol/L，按“2.4.1”项下步骤反应，终止后，HPLC 测定探针代谢产物 E-3-G 的含量，采用GraphPad Prism 5 处理数据，计算芫花醇提物对

UGT1A1 抑制作用的 IC50值。

2.6 芫花醇提物对 UGT1A1 抑制类型的确定

对 IC50＜100 mol/L 的反应体系，进一步分析芫花醇提物对 UGT1A1 的抑制类型。配制3个不同浓度的探针底物溶液，在孵育体系中，分别加入不同浓度的探针药物和芫花醇提物反应一定时间后，终止反

应，按“2.4.1”项下处理样品， HPLC分析代谢产物

（E-3-G）的含量，根据 Lineweaver-Burk 和 Dixon-Plot图，计算抑制常数Ki，判断抑制类型。

2.7 数据处理

采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据用x±s —表示。各组数据均进行线性回归分析，同时进行方差分析，方差不齐者采用非参数检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果 3.1 芫花醇提物主要成分含量测定

1 kg芫花原材料所得芫花提取物为 164.12 g。芫花醇提物中3种黄酮成分芹菜素、羟基芫花素、芫花素的含量分别为 6.34%、8.72%、6.06%，即羟基芫花素＞芹菜素＞芫花素；总二萜含量为 31.40%。醇提物浓度以羟基芫花素计，浓度为80.51 mol/L。

3.2 芫花醇提物对 UGTs 活性的影响

与空白组比较，芫花醇提物均可显著抑制RLM、HLM孵育体系中 UGTs活性，结果见表1。表1 芫花醇提物对肝微粒体UGTs 活性的影响[x±s，mol/(mg•min)，n＝6]—组别 RLM HLM

空白组 0.043±0.000 3 0.039±0.000 5

芫花醇提物 0.014±0.007 1* 0.018±0.003 1**注：与空白组比较，*P＜0.01，**P＜0.001

3.3 芫花醇提物对 UGT1A1 活性的影响

芫花醇提物浓度依赖性地抑制UGT1A1 的活性，

以羟基芫花素计，IC50分别为 46.32 mol/L（RLM）、

32.49 mol/L（HLM）、8.382 mol/L（rhUGT1A1），见图 5A、图 6A、图 7A。Lineweaver-Burk 和 Dixon-plot图表明，芫花醇提物在 RLM、rhUGT1A1 体系中对

UGT1A1的抑制类型为竞争性抑制作用（见图5B、C，图 7B、C），以 Lineweaver-Burk 斜率和芫花醇提物浓度作图计算出在 RLM、rhUGT1A1 体系中的抑制动力

学参数Ki分别为 32.31、5.59 µmol/L（见图 5D、图7D）；芫花醇提物在HLM体系中对UGT1A1的抑制类型为反竞争性抑制作用（见图6B、C），以 Lineweaver-Burk斜率和芫花醇提物浓度作图计算出抑制动力学参数Ki为 1.464 µmol/L（见图 6D）。

4 讨论

UGTs 是体内最重要的Ⅱ相代谢酶，主要分布于肝脏、肠道、肾脏等器官。其功能是催化外源性药物、内源性物质发生葡萄糖醛酸化结合反应，转化为极性较强的结合物，增加底物的亲水性，使其能更有效地从尿或胆汁中排出体外，这是机体的一个重要解毒过

程[20-21]。已有学者通过血清生化指标和组织病理学筛选出芫花醇提物的氯仿萃取部位是芫花致肝毒性部位，并鉴定该部分含有黄酮类成分（芫花素、芹菜素、

羟基芫花素）、木脂素类及二萜原酸酯类等成分[10]。本研究测定芫花醇提物对不同种属肝微粒体中 UGTs和 UGT1A1活性的影响发现，芫花醇提物对RLM 和HLM 孵育体系中 UGTs 均产生了显著的抑制作用，并且其抑制率均大于50%，这提示在芫花醇提物中存在某些成分可作为UGTs抑制剂，具有导致毒性发生的潜在可能性。

UGTs 的数量和活性直接影响药物在体内的代谢消除，对维持机体的稳定及药物发生药效至关重要。对于RLM和rhUGT1A1体系，芫花醇提物对UGT1A1表现为中等强度的抑制作用，其抑制类型均为竞争性

抑制作用（IC50分别为 46.32、8.382 µmol/L）；对于HLM体系，芫花醇提物对 UGT1A1 表现为中等强度

抑制作用，其抑制类型为反竞争性抑制作用（IC50为

32.49 µmol/L）。由以上结果可知，芫花醇提物对不同种属中 UGT1A1 的抑制程度不同，其抑制作用为

rhUGT1A1＞HLM＞RLM；推测原因可能为，药物代谢酶存在种属差异，药物作用于不同种属 UGT1A1时呈现出不同的效果。

本研究结果提示，当芫花与UGT1A1 底物药物联合使用，或长时间大剂量单独用药时，均可能发生药物代谢性相互作用或扰乱体内内源性物质的正常代谢。结合本实验室前期研究羟基芫花素对 UGT 酶的

活性影响[18]及 Chen Y 等[22]和张亚洲等[23]报道的芹菜素和芫花酯戊在体内的代谢消除均需UGTs 的参与，本研究通过芫花醇提物对UGTs和UGT1A1活性的抑制作用，推测Ⅱ相代谢作用可能造成芫花的毒性成分

如芫花二萜成分[24]或次生毒性代谢物在体内的代谢转化受阻，导致其在体内滞留蓄积从而产生毒性，这可能为芫花致毒的机制之一，为芫花致肝损伤研究提供新思路、新方法，其具体作用机制还需进一步探讨。

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（收稿日期：2016-08-02）

（修回日期：2016-08-25；编辑：陈静）