青翘与老翘功效差异在经典方剂中的验证研究

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 - 基金项目:国家自然科学基金面上项目(81470169);山西省基础研究项目(2015021196) 通讯作者:倪艳,E-mail:niyan_01@hotmail.com

孙迎娜,岳永花,刘聪,何盼,白关亚,倪艳

山西省中医药研究院,山西 太原 030012

摘要:目的 采用经典方剂连翘散和银翘散验证青翘和老翘的功效差异,为指导连翘“一体两用”提供实验依据。方法 采用金黄色葡萄球菌制作豚鼠疮疡模型,将40只豚鼠随机分为空白组、模型组、连翘散青翘组和连翘散老翘组,空白组和模型组灌服生理盐水,连翘散青翘组和连翘散老翘组灌服1.2 g 原药材/kg 药液,连续7d,观察各组模型豚鼠疮疡症状积分、血常规及病理变化。采用10%脂多糖雾化吸入法诱导大鼠急性肺损伤模型,将 40 只 SD 大鼠随机分为空白组、模型组、银翘散青翘组和银翘散老翘组,空白组和模型组灌服生理盐水,银翘散青翘组和银翘散老翘组灌服4g 原药材/kg药液,连续10 d,观察各组大鼠肺洗液白细胞介

素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β 水平。结果 连翘散青翘组抑制豚鼠疮疡伤口红肿作用较老翘组起效快,但在抑制豚鼠疮疡伤口分泌物和病理改善方面与连翘散老翘组差异无统计学意义。银翘散青翘组大鼠较老翘组 IL-6、TNF-α、IL-1β 含量降低,但差异无统计学意义。结论 不同复方中青翘与老翘功效有一定差异。关键词:青翘;老翘;连翘散;银翘散;疮疡模型;急性肺损伤模型;功效差异

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.010

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)05-0039-05

Validation Study on Efficacy Difference of Green Forsythiae Fructus and Ripe Forsythiae Fructus in the Classic Formula

SUN Ying-na, YUE Yong-hua, LIU Cong, HE Pan, BAI Guan-ya, Ni Yan (Shanxi Institute of Traditional Chinese Medicine, Taiyuan 030012, China)

Abstract: Objective To compare the efficacy difference of Green Forsythiae Fructus and Ripe Forsythiae Fructusby using Lianqiao powder and Yinqiao powder in the classic formula; To provide experimental evidence for the guidance of “one for dual-use” of the Forsythiae Fructus. Methods The guinea pig sore model was made with Staphylococcus aureus. 40 guinea pigs were randomly divided into blank group, model group, Lianqiao powder Green Forsythiae Fructus group and Lianqiao powder Ripe Forsythiae Fructus group. The blank group and the model group were fed with normal saline, while Lianqiao powder Green Forsythiae Fructus group and Lianqiao powder Ripe Forsythiae Fructus group were treated with 1.2 g raw medicine/kg liquid Lianqiao powder Green Forsythiae Fructus and Lianqiao powder Ripe Forsythiae Fructus for 7 d. The symptom score, blood and pathological changes of guinea pig soreness were observed. The model of acute lung injury was induced by 10% LPS aerosol inhalation. 40 rats were randomly divided into blank group, model group, Yinqiao powder Green Forsythiae Fructus group and Yinqiao powder Ripe Forsythiae Fructus group. The blank group and the model group were fed with normal saline, while Yinqiao powder Green Forsythiae Fructus group and Yinqiao powder Ripe Forsythiae Fructus group were treated with

4 g raw medicine/kg liquid Yinqiao powder Green Forsythiae Fructus and Yinqiao powder Ripe Forsythiae Fructus for

10 d. The levels of IL-6, TNF-α and IL-1β in the lung lavage fluid were detected. Results The effect of Lianqiao powder Green Forsythiae Fructus on the wound healing of guinea pig sore wound was faster than that of Lianqiao powder Ripe Forsythiae Fructus, but there was no significant difference between Lianqiao powder Green Forsythiae Fructus group and Lianqiao powder Ripe Forsythiae Fructus group in inhibiting the secretion and pathological

changes of guinea pig sore wound. The levels of IL-6, TNF-α and IL-1β in Yinqiao powder Green Forsythiae Fructus group was lower than that in Yinqiao powder Green Forsythiae Fructus group, without statistical significance. Conclusion It is verified that there is efficacy differences between Green Forsythiae Fructus and Ripe Forsythiae Fructus in the different Chinese herbal compound.

Key words: Green Forsythiae Fructus; Green Forsythiae Fructus; Lianqiao powder; Yinqiao powder; sore model; acute lung injury model; efficacy difference

连翘系木犀科植物连翘 Forsythia suspensa (Thunb.)Vahl 的干燥果实。根据采收时间的不同,通常将连翘分为青翘和老翘。青翘为秋季果实初熟尚带绿色时采收,除去杂质,蒸熟,晒干而成;老翘则

为果实熟透时采收,晒干,除去杂质而成[1]。在现行

标准中,已在【检查】项下“杂质”和【浸出物】2项中分别对“青翘”和“老翘”进行了控制,其指标

值相差较大[1]。但在连翘药材流通与临床实际应用中并无“青”与“老”的区分,二者常混杂而用,标准与应用脱节。同时,大量文献表明青翘和老翘在化学

成分、药理作用方面存在一定差异[2-5]。可见,青翘与老翘确有功效差异。然而,这些研究只是基于连翘单味进行比较,单味功效差异在复方配伍应用时如何尚需进一步研究。为此,本实验选择连翘散和银翘散

2 个经典方剂进行相应药效指标比较,进一步评价青翘和老翘的功效差异,以期为连翘的临床合理应用提供依据。

1 实验材料

1.1 药物

青翘、老翘(山西产),购自亳州成源中药饮片有限公司,批号 20140703,经山西省中医药研究院倪艳教授鉴定均为木犀科落叶灌木连翘 Forsythia suspense(Thunb.)Vahl 的干燥果实。栀子、甘草、防风、金银花、桔梗、薄荷、竹叶、甘草、荆芥穗、豆豉、牛蒡子,饮片购自山西省中医院中药房。

1.2 主要试剂与仪器

金黄色葡萄球菌ATCC6538(上海鲁微科技有限公司,批号A1008B),营养琼脂培养基(杭州微生物试剂有限公司,批号 20150425-00),脂多糖(LPS, Solarbio,批号 818E035),白细胞介素(IL)-6、肿

瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β ELISA 试剂盒(武汉博士德生物,批号均为 EK0393)。SE402F 奥豪斯电

子天平(奥豪斯仪器上海有限公司),KDC-2046 低速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司),

培养箱(购自上海鲁微科技有限公司),Finesse325石蜡切片机(英国 Shandon),SIGMA1-14 高速离心机石蜡包埋机(Histocentre 3,英国 Shandon),Excelsior 全自动组织脱水机(英国 Shandon),BX53 荧光显微成像系统(日本 Olympus),BS2-Ⅰ电热三用水箱(北京市医疗设备厂),Synergy H1 全功能微孔板检测仪(美国 BioTek)。

1.3 动物

雄性健康豚鼠 40 只,10 周龄,体质量(300±

20)g,雄性健康 SD 大鼠 40 只,12 周龄,体质量

(200±20)g,北京华阜康生物科技股份有限公司,动物许可证号 SCXK(京)2013-0005。饲养于清洁恒温环境,温度25 ℃,平均湿度 37%,15~20 次/h 全

新风,12 h光照明暗交替,自由摄食饮水。

1.4 供试品制备

1.4.1 连翘散 连翘散青翘供试品制备:分别取青翘、栀子、甘草、防风各30 g,加 8倍量水浸泡1 h,煎煮 0.5 h,滤出药液,药渣再加8倍量水煎煮 0.5 h,合并药液并浓缩,干膏率为 19.99%。用蒸馏水溶解配成浓度为 0.12 g /mL的受试药液。连翘散老翘供试品制备:同上取药制备,将青翘改为老翘,干膏率为

21.61%。同上配成浓度为 0.12 g /mL的受试药液。

1.4.2 银翘散 银翘散青翘供试品制备:取青翘

60 g、金银花 60 g、桔梗 36 g、薄荷 36 g、竹叶 24 g、甘草 30 g、荆芥穗 24 g、豆豉 30 g、牛蒡子 36 g,加

8倍量水浸泡 1 h,煎煮 0.5 h,滤出药液,药渣再加

8倍量水煎煮 0.5 h,合并药液并浓缩、干燥,干膏率为 19.63%。用蒸馏水溶解配成浓度为 0.4 g/mL 的受试药液。银翘散老翘供试品制备:同上取药制备,将青翘改为老翘,干膏率为 20.40%。同上配成浓度为

0.4 g/mL 的受试药液。

2 实验方法 2.1 豚鼠疮疡实验

2.1.1 造模、分组及给药 除 10只空白组豚鼠外,其余豚鼠均右侧腹部脱毛,麻醉后用刀片在脱毛部位划一十字切口,于皮下注入9 亿/L金黄色葡萄球菌溶液 0.5 mL,每日 1次,连续3 d,至伤口周围出现红、

肿、触痛,可见脓性分泌物为止[6]。取成模豚鼠 30只,随机均分为模型组、连翘散青翘组、连翘散老翘组。连翘散青翘组和连翘散老翘组按 10 mL/kg 剂量

灌服 1.2 g 原药材/kg(相当于临床用药 7.5 倍)的药液,空白组和模型组灌服等量生理盐水,连续 7 d。给药过程中,因灌胃误吸导致4只豚鼠死亡。

2.1.2 检测指标 每次给药后1 h,肉眼观察给药后疮疡皮肤的红肿、分泌物等反应症状,参考表1 反应

症状和评分标准评分[7]。末次给药评分结束后,豚鼠麻醉,心脏取血,置于抗凝管中,检测血象。解剖实验动物,剔除肺部有误吸的豚鼠,分离局部疮疡皮肤,

10%福尔马林固定后送病理检查。病理检查结果评分:“-”皮肤各层结构,毛囊、皮脂腺、皮下组织均

正常;“+”皮肤各层结构,毛囊、皮脂腺存在,溃疡

周围有大量肉芽组织和结缔组织形成;“++”皮肤各层结构存在,毛囊、皮脂腺、毛杆数量轻度减少,溃

疡周围有少量肉芽组织和轻度炎细胞浸润;“+++”皮肤正常结构消失,未见毛囊、皮脂腺及毛杆,而溃疡周围大量炎细胞浸润和纤维增生。

2.2 大鼠急性肺损伤实验

2.2.1 造模、分组及给药 SD 大鼠随机分为空白组、模型组、银翘散青翘组、银翘散老翘组,每组10只。银翘散青翘组和银翘散老翘组按 10 mL/kg 剂量灌服 4 g 原药材/kg(相当于临床用药的 15 倍)的相应药液,空白组和模型组灌服等量生理盐水,连续10 d。 末次给药后,除空白组外,各组大鼠予20 mL 10%LPS溶液经超声波雾化器雾化30 min[8]。

2.2.2 检测指标 吸入内毒素后4 h,各组大鼠麻醉仰卧固定,于颈正中切开暴露气管,插入磨圆的注射

器针头,5 mL 生理盐水通过气管插管慢慢注入气管内,反复抽吸几次,将洗液抽出,回收洗液2 mL[9]。将洗液放置1 h 后,3000 r/min 离心 15 min,收集上清液。ELISA 试剂盒测定肺洗液中 IL-6、TNF-α 和

IL-1β 的含量。

3 统计学方法

采用 SPSS15.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s表示,组间比较用t检验,等级资料采用 Ridit 检—

验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 连翘散对豚鼠疮疡模型皮肤红肿、分泌物的影响

给药第3日,与模型组比较,连翘散青翘组豚鼠疮疡皮肤红肿、分泌物评分降低,连翘散老翘组豚鼠

疮疡皮肤分泌物评分降低(P<0.05,P<0.01),而对豚鼠疮疡皮肤红肿抑制作用不明显;给药第7日,连翘散青翘组豚鼠疮疡皮肤红肿、分泌物评分降低(P<

0.05),连翘散老翘组豚鼠疮疡皮肤红肿、分泌物评分

降低(P<0.01)。给药第 3日,连翘散青翘组抑制疮疡皮肤红肿和分泌物的作用稍优于连翘散老翘组(P>

0.05);给药第 7日,连翘散老翘组抑制疮疡皮肤红肿

和分泌物的作用较连翘散青翘组强(P>0.05)。见表2。

4.2 连翘散对豚鼠疮疡模型血常规的影响

与空白组比较,模型组白细胞、淋巴细胞、中性

粒细胞、粒细胞变化不明显(P>0.05);与模型组比较,

给药组也未见明显差异(P>0.05)。见表 3。

4.3 连翘散对豚鼠疮疡模型病理形态的影响

空白组可见皮肤组织较薄的鳞状上皮和角化层,皮下组织的毛囊、皮脂腺、毛杆以及皮下肌肉层形态正常结构清楚;模型组可见表层鳞状上皮轻度增生,未见毛囊、皮脂腺及毛杆,皮肤正常结构消失,表皮层及真皮层结缔组织形成,炎细胞浸润;各给药组可见表皮层下结缔组织形成,真皮层肉芽组织形成及轻度炎细胞浸润,部分样本皮脂腺、毛囊、毛杆不同程度损伤、数量减少,见图1。每组随机取 5 只豚鼠疮疡皮肤做病理检查,与空白组比较,模型组病理变化

明显加重(P<0.01);与模型组比较,连翘散青翘组

和连翘散老翘组病理变化均明显改善(P<0.05,P<

0.01);与连翘散青翘组比较,连翘散老翘组病理变化改善不明显,见表4。

4.4 银翘散对大鼠急性肺损伤模型相关炎症因子的影响

与空白组比较,模型组肺洗液中 IL-6、TNF-α、

IL-1β 含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,银翘散青翘组 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量显著降低(P<

0.05,P<0.01),银翘散老翘组 TNF-α、IL-6 显著降

5 讨论

连翘性微寒,味苦,具有清热解毒、消肿散结的功效,适用于温热、丹毒、斑疹、痈疡肿毒及过敏性紫癜等。在临床应用中,连翘作为各中药复方中的主要组成药物,一方面多用于外感风热,并伴有脉浮数或咽痛等,治以疏风解表、清热解毒,代表方剂为银翘散,现代临床也常将银翘散用于治疗急性上呼吸道

感染和肺炎等[10];另一方面,连翘又为疮家圣药,常用于治疗热毒蕴结所致的各种疮毒痈肿,代表方剂为连翘散。据《外科精义》中记载,连翘散“治疮疡疖肿,一切恶疮,疼痛烦渴”。

疮疡是临床常见的外科疾病,发病迅速,易出现感染,形成疮疡。目前常通过动物人工创伤并用金黄色葡萄球菌感染方法制作疮疡模型,疮伤感染后,大量炎细胞浸润,使血管壁通透性增加,产生红、肿、

热、痛现象,并有脓性分泌物出现[11]。由豚鼠疮疡实

低(P<0.05);与银翘散老翘组比较,银翘散青翘组

TNF-α、IL-6、IL-1β 含量略降低(P>0.05)。见表 5。 验评分结果可以看出,在感染金黄色葡萄球菌早期,连翘散青翘组抑制豚鼠疮疡伤口红肿的作用较连翘散老翘组起效快。因此,本课题组推测在连翘散治疗疮疡疾病早期,选用青翘入药时其抑制红肿和分泌物的作用比老翘入药时起效快,可能与青翘对金黄色葡

萄球菌的抗菌作用强有关,与已有报道一致[4,12]。急性肺损伤是由多种炎性介质及效应细胞共同

参与,并呈级联放大的瀑布样炎症继发性损伤[13]。细菌内毒素可以在机体内激活多种炎症因子,如IL-1、

IL-6、IL-8 等,使炎症细胞活化,损伤肺泡上皮细胞及肺毛细血管内皮细胞,并引起机体一系列炎症反

应[14-15]。本实验结果显示,各给药组肺洗液中 IL-6,

TNF-α、IL-1β 水平均与模型组有明显差异,银翘散治疗 LPS引起的炎症反应作用明显;同时发现银翘散青翘组降低 IL-6、TNF-α、IL-1β 水平均优于银翘散老翘组。因此,在银翘散治疗上呼吸道感染等炎症疾病时,

选用青翘入药治疗效果要优于老翘。

上述实验研究初步表明,青翘和老翘存在一定的功效差异。本研究提示青翘抗炎作用优于老翘,同时青翘抑制红肿和分泌物的作用比老翘起效快,但差异无统计学意义,后期课题组结合目前青翘与老翘单方的大量研究,拟选定大量的含连翘经典复方,通过代谢组学、分子生物学等方法进一步明确青翘和老翘的药效学差异,以实现临床使用过程中分而用之的必要性,也要求对青翘和老翘制定行之有效的质量标准,以期彻底解决连翘流通、使用等环节的混乱局面。

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