木瓜提取物对高糖高脂诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝病的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

吴利春1,涂浩 1,段丽 1,佘慧宇 2,张伟 1,张长城 2,袁丁 2,刘朝奇 1

1.肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室,湖北 宜昌 443002;

2.三峡大学医学院,湖北 宜昌 443002

摘要:目的 观察木瓜提取物对小鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的影响,探讨其可能的分子机制。方法 将 40只雄性昆明小鼠随机分成正常组、模型组和药物低(50 mg/kg)、高(100 mg/kg)剂量组。正常

组给予普通饲料,其他组给予高糖高脂饲养造模,4周后处死,检测体质量、肝脏质量、血清相关指标及肝脏三酰甘油(TG)水平,HE及油红O染色观察肝脏组织形态,RT-PCR和 Western blot检测脂代谢相关基因表达。结果 与正常组比较,模型组小鼠肝脏明显增大,肝指数明显升高(P<0.01),附睾脂肪指数明显升高(P<

0.05);血清丙氨酸氨基转移酶和葡萄糖水平升高(P<0.05);肝脏 TG水平升高(P<0.05);病理结果显示,肝脏脂肪变性明显;RT-PCR 和 Western blot 结果显示,模型组肝脏组织 SIRT1、FoxO1 表达水平下调,SERBP-1c表达水平上调。与模型组比较,药物低、高剂量组脂肪肝病理损伤明显改善,肝指数、肝脏TG含量均下降,

SIRT1 和 FoxO1 表达水平上调。结论 木瓜提取物对高糖高脂诱导的 NAFLD 有保护作用,其机制可能是通过 SIRT1-FoxO1 信号通路发挥作用。

关键词:木瓜提取物;非酒精性脂肪性肝病;脂质代谢;SIRT1信号通路;小鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.012

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)05-0048-04

Effects of Extracted Active Components of Chaenomeles Speciosa on Non-alcoholic Fatty Liver Disease in Model Mice induced by High-fat–high-fructose Diet

WU Li-chun1, TU Hao1, DUAN Li1, SHE Hui-yu2, ZHANG Wei1, ZHANG Chang-cheng2, YUAN Ding2, LIU Chao-qi1 (1. Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy, Yichang 443002, China; 2. Medical College, China Three Gorges University, Yichang 443002, China)

Abstract: Objective To study the effects of extracted active components of Chaenomeles Speciosa (EACCS) on non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in mice; To discuss the possible molecular mechanism. Methods Forty male KM mice were randomized into four groups, namely normal group, model group, low-dose (50 mg/kg) EACCS group and high-dose (100 mg/kg) EACCS group. Except that the normal group was daily given routine diet, the other groups were given high-fat–high-fructose diet (HFFD). The mice were put to death 4 weeks later. Body weight, liver weight and serum TG were measured. HE and oil red O staining were used to observe liver tissue morphology. RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of lipid metabolism related genes. Results Compared with the normal group, the liver size, liver index (P<0.01) and epididymal fat index (P<0.05) increased significantly; The ALT and GLU in serum increased (P<0.05), TG increased (P<0.05), and pathological findings showed significant steatosis; RT-PCR and Western blot showed that the expression levels of SIRT1 and FoxO1 mRNA decreased and the level of SERBP-1c increased in the model group. Compared with the model group, the hepatic lipid accumulation of EACCS groups was obviously improved, and the serum ALT, GLU, and TG levels significantly decreased, the expression levels of hepatic SIRT1 and FoxO1 mRNA increased. Conclusion EACCS has protective effects on NAFLD mice induced by HFFD, and its mechanism may be related to the activation of SIRT1-FoxO1 signaling

pathway in the liver tissues.

Key words: Chaenomeles Speciosa extracts; non-alcoholic fatty liver disease; lipid metabolism; SIRT1 signaling pathway; mice

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指无饮酒或每周饮酒低于 140 g,由其他各种原因导致的肝细胞脂肪变性,三酰甘油(TG)明显升高,进一步发展成脂肪性肝炎、肝纤维化甚至肝癌的一组临床综合征。随着我国居民生活水平不断提高,体力劳动减少,NAFLD 发病率逐年上升,大、中城市普通成人的 NAFLD 发病率高达

20%[1],至今尚无有效的干预措施。因此,急需寻找有效手段防治 NAFLD。木瓜是蔷薇科植物贴梗海棠近成熟果实,味酸、性温、归肝脾经,具有祛湿舒筋、

平肝和胃的作用[2]。本课题组前期研究发现,木瓜对小鼠 NAFLD 具有良好的干预作用[3]。为此,本实验对木瓜进行提取分离,进一步研究该药物有效成分对NAFLD的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法 1.1 动物及饲料

雄性昆明小鼠 40 只,SPF 级,4~6 周龄,体质量 18~22 g,三峡大学实验动物中心。饲养于室温

20~25 ℃、相对湿度 50%~80%、明暗交替 12 h/12 h环境,自由摄食饮水,每2d 称重 1次。高糖高脂饲料:按照 56.5%普通饲料、30%果糖、10%猪油、3%

胆固醇、0.5%胆酸钠的比例压制而成。

1.2 药物及制备

将木瓜块粉碎成粗粉后按料液比1∶10加入60%乙醇,浸泡2h,水浴回流提取3次,每次2 h,过滤。合并 3次滤液,减压回收乙醇至无醇味。取木瓜提取液适量,通过大孔树脂进一步分离,应用梯度乙醇作为移动相,收集相应洗脱液,进行浓缩、干燥,获取不同组分木瓜提取物。本实验中应用的是在细胞水平已筛选活性较好的10%乙醇洗脱组分,命名为10%醇木瓜组分,用于后续实验。

1.3 主要试剂与仪器

胆固醇,国药集团化学试剂有限公司;总 RNA提取试剂盒、反转录试剂盒,大连宝生物科技有限公司提供;PCR引物,生工生物工程(上海)股份有限公司合成;兔单抗 β-actin(sc-4778),兔多抗 FoxO3a

(ab1096290),美国 Santa Cruz 公司;兔多抗 SIRT1

(#07-131),Millipore 公司;羊抗兔二抗,武汉科瑞有限公司提供;显影化学发光剂ECL,碧云天生物技术研究所。Powerpas Basic 蛋白电泳仪器,美国伯乐 公司;梯度PCR 仪,德国 Applied Biosysterms 公司; Gellogic 200凝胶成像分析系统,美国柯达公司。

1.4 造模

将 40 只雄性昆明小鼠随机分为正常组、模型组和药物低、高剂量组,每组 10 只。除正常组给予普通饲料外,其余各组均给予高糖高脂饲料造模,药物低、高剂量组分别给予50、100 mg/kg 药物灌胃,正常组和模型组给予生理盐水灌胃。给药体积0.5 mL/d,连续 4 周。

1.5 血清及肝脏生化指标测定

小鼠脱颈椎处死,眼球取血,室温静置30 min,

3000 r/min 离心 10 min后取血清,按葡萄糖(GLU)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒说明书进行检测。称取 100 mg肝脏组织,加入900 μL 95%异丙醇于冰上研磨,室温静置2 h,4 ℃、2000 r/min 离心

4 min,取上清液,并按试剂盒说明书检测TG含量。

1.6 肝指数及附睾脂肪指数测定

处死小鼠前称重,处死后完整取下肝脏及附睾脂肪组织,分别称重,计算肝指数(肝脏质量÷体质量)和附睾脂肪指数(附睾脂肪质量÷体质量)。

1.7 肝组织 HE 和油红O染色

取 10 mm×3 mm新鲜肝脏大叶放入包埋盒中,于10%中性甲醛溶液中固定24 h,用水清洗后经梯度乙醇脱水,石蜡包埋切片(厚度4 μm),HE染色,显微镜下观察肝细胞结构及病理变化。取新鲜肝脏作冰冻切片,油红O染色,显微镜下观察肝细胞脂肪变性情况。

1.8 RT-PCR 检测肝组织 mRNA 表达

应用试剂盒提取总 RNA,测定浓度,通过电泳观察 RNA 的完整性。按照反转录试剂盒说明书操作获得 cDNA,并进行 PCR扩增。引物序列见表 1。PCR反应体系总体积为25 —L:10.5 —L DEPC 水,12.5 —L PCR Master mix(2×),加入 SIRT1、FoxO1、SREBP、GAPDH引物上下游各 0.5 —L,最后加入 cDNA 模板1 —L。使用 GAPDH 作为内参。产物经2%琼脂糖凝胶电泳,采用凝胶成像分析系统测定灰度平均值,以样品各基因的灰度值与其内参照GAPDH的比值代表其 mRNA相对量。

1.9 Western blot检测肝组织蛋白表达

称取 50~100 mg肝脏组织匀浆后,加入蛋白裂解液提取总蛋白。95 ℃变性 5~10 min,SDS-PAGE

电泳和转膜,再 5%牛奶封闭,4 ℃一抗孵育过夜,二抗室温孵育 1h,ECL 显色。应用 Image J软件进行灰度扫描分析,以样品各基因的灰度值与其内参照β-actin 的比值代表蛋白相对表达量。

.2 木瓜提取物对模型小鼠肝组织病理变化的影响

HE 染色结果显示:正常组肝索围绕中央静脉呈射状紧密排列,肝细胞形状规则,细胞排列紧密均;模型组肝细胞中含有较大脂滴,细胞肿大变圆,叶中央区受累更明显,细胞排列较紊乱,炎性细胞润;药物低、高剂量组较模型组脂滴更小,细胞排列更为紧密,中央静脉区受累情况均有明显改善。结果见图1。 油红 O 染色结果显示:正常组肝脏组织结构正常,中央静脉周围的肝索呈放射状排列,结构清晰,

1.10统计学方法

采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s 表示,组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异—

有统计学意义。

2结果

2.1木瓜提取物对模型小鼠相关指标的影响

与正常组比较,模型组肝脏指数、附睾脂肪指数、肝脏TG含量及血清 GLU、ALT水平明显升高(P<

0.05,P<0.01);与模型组比较,药物各剂量组均有不同程度改善,其中药物高剂量组肝脏指数、附睾脂肪指数及血清 ALT、GLU 水平明显降低(P<0.05,

P<0.01),药物低剂量组肝脏TG含量明显降低(P<

0.05)。结果见表 2。

— 肝细胞无脂肪变性;模型组有一定程度的肝细胞肿胀、胞浆淡染,有大量的脂肪空泡形成,肝索结构紊乱;药物低、高剂量组较模型组肝组织结构基本正常,红色脂滴明显减少。结果见图2。

2.3木瓜提取物对模型小鼠脂代谢相关基因表达的影响

RT-PCR 结果显示,模型组 FoxO1 和 SIRT1 表达较正常组均降低,而 SREBP-1c 基因表达升高;与模型组比较,药物低、高剂量组 FoxO1 和 SIRT1 表达升高,SREBP-1c基因表达明显降低。结果见图3。

2.4 木瓜提取物对模型小鼠肝组织 FoxO1 和 SIRT1蛋白表达的影响

Western blot 结果显示,模型组 SIRT1 和 FoxO1蛋白表达明显低于正常组;与模型组比较,药物低、高剂量组 FoxO1 和 SIRT1 蛋白表达明显升高。结果见图4。

3 讨论

肝细胞的糖脂代谢紊乱是发生NAFLD的重要机

制,SIRT1-FoxO1 通路是调节肝脏脂质代谢的重要通

路。SIRT1 可以通过 FoxO1转录因子的脱乙酰化使其核转位,诱导脂肪分解中限速酶的转录调节,引起其下游的脂肪生成基因的表达量下调,从而抑制脂肪细

胞的分化[4]。Deng X 等[5]报道 FoxO1 可通过调节

SREBP-1c 启动子的转录起始复合物的组装,尤其是

SP1 和 SREBP-1c 的结构域的结合,从而可以抑制

SREBP-1的表达,调控肝细胞的脂代谢,促进脂肪动员,降低脂肪沉积。在NAFLD发生发展中 SIRT1 的表达明显降低,从而抑制 FoxO1 的活性,导致

SREBP-1 表达增加,使肝细胞脂代谢紊乱[6],据此推测 SIRT1 可能是治疗 NAFLD的潜在靶点。同时有文献报道,用腺病毒载体过表达 SIRT1,能改善 ob/ob小鼠肝脏脂质沉积,而特异敲除小鼠肝细胞中SIRT1基因,在高糖高脂饮食诱导下可以加速高脂血症、脂

肪肝的发生[7-8]。本实验建立的 NAFLD 模型所致的

SIRT1-FoxO1 通路变化与文献结果相符,提示建立的模型可用于药物筛选。

本实验在前期研究的基础上应用高糖高脂饲料诱导小鼠 NAFLD 模型,用10%醇木瓜组分低、高剂

量进行干预处理。实验结果显示,10%醇木瓜组分可 有效干预 NAFLD 的脂代谢紊乱,降低 TG 水平,改善肝脏脂质沉积状况。在诱导的 NAFLD 模型中,

SIRT1 及 FoxO 的表达明显下调,加入不同剂量10%

醇木瓜组分干预后,SIRT1 及 FoxO 的表达较模型组均有一定程度的上调,并呈现出一定的量效关系。有研究发现,α-硫辛酸可增强 Sirtuin 1去乙酰化酶活性,阻止 SREBP-1 的入核和 FoxO1 进入细胞质,增加TG

脂肪酶的表达和减少脂肪酸合酶的丰度[9]。本实验结

果显示,10%醇木瓜组分能有效改善肝脏脂质代谢紊乱,调节 SIRT1-FoxO1 信号分子,与文献报道一致,提示该药物可能通过 SIRT1-FoxO1 通路,抑制

SREBP-1 的活性,从而干预NAFLD的发生和发展。

综上,本实验结果显示,10%醇木瓜组分对高糖高脂诱导的 NAFLD模型有较好的干预作用,为进一步开发治疗 NAFLD的药物提供了实验依据。

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(收稿日期:2016-11-09)

(修回日期:2016-12-28;编辑:华强)

药物高剂量组 图 1 HE染色各组小鼠肝组织病理形态(×200)

药物高剂量组 O染色各组小鼠肝组织病理形态(×200)

药物低剂量组 图 2油红

正常组

模型组

模型组

正常组

药物低剂量组

注:A.正常组;B.模型组;C.药物低剂量组;D.药物高剂量组图3各组小鼠肝组织脂代谢相关基因表达凝胶电泳图

注:A.正常组;B.模型组;C.药物低剂量组;D.药物高剂量组图4各组小鼠肝组织 FoxO1 和 SIRT1蛋白表达免疫印迹电泳图

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