芪参二莲汤对肝纤维化大鼠血清基质金属蛋白酶-1及其抑制剂-1水平的影响

2017-05-15 -

袁星星1，郭蕾 2，王炳予 1，杨磊 1，刘长发 1，张雅丽 1

1.黑龙江省中医药科学院南岗分院，黑龙江哈尔滨 150001；

2.齐齐哈尔市中医院，黑龙江齐齐哈尔 161000

摘要：目的观察芪参二莲汤对硫代乙酰胺（TAA）诱导大鼠肝纤维化的逆转作用和血清基质金属蛋白酶-1

（MMP-1）及其抑制剂-1（TIMP-1）水平的影响，探讨其作用机制。方法采用 TAA灌胃法制造肝纤维化模

型，120 只 SPF 级 SD雄性大鼠按体质量随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组和芪参二莲汤低、中、高剂量组，各给药组给予相应药物灌胃，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续5周。采用HE 和Masson 染色观察肝脏组织病理形态及损伤程度，采用生化分析、放免法、ELISA检测血清肝功能、肝纤维化四项及 MMP-1、TIMP-1 水平。结果与模型组比较，芪参二莲汤各剂量组均能显著降低大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、γ-谷氨酰转酞酶及透明质酸、层黏连蛋白、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶

原水平，MMP-1 和 MMP-1/TIMP-1 比值显著升高，TIMP-1 水平显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05，

P＜0.01)，并且存在一定的量效关系，以芪参二莲汤高剂量组疗效最佳。结论芪参二莲汤可明显改善肝纤维化大鼠肝功能及肝纤维化指标，调控MMP-1 与 TIMP-1水平，阻止肝纤维化病情的进展。

关键词：芪参二莲汤；肝纤维化；细胞外基质；基质金属蛋白酶-1；金属蛋白酶抑制剂-1；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.013

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2017)05-0052-05

Effects of Qishen Erlian Decoction on Serum MMP-1 and TIMP-1 in Liver Fibrosis Model Rats

YUAN Xing-xing1, GUO Lei2, WANG Bing-yu1, YANG Lei1, LIU Chang-fa1, ZHANG Ya-li1 (1. Nangang Branch of Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150001, China; 2. Qiqihar Hospital of Traditional Chinese Medicine, Qiqihar 161000, China)

Abstract: Objective To investigate the effects of Qishen Erlian Decoction on serum MMP-1 and TIMP-1 levels in thioacetamide (TAA) induced liver fibrosis rats; To discuss its mechanism of action. Methods Liver fibrosis model was created by the TAA gavage method. 120 SD male rats were randomly assigned to control group, model group, colchicine group, Qishen Erlian Decoction low-, medium- and high-dose group (20 in each group). Each medication group was given relevant medicine for gavage. Control group and model group were given the same amount of normal saline for gavage, once a day for 5 weeks. HE staining and Masson trichrome staining were used to observe the pathological changes in liver tissue and liver tissue damage. Biochemistry, radioimmunoassay, and ELISA were used to detect the serum liver function, hepatic fibrosis index, MMP-1 and TIMP-1 levels. Results Compared with the model group, serum ALT, AST, TBIL, γ-GGT, HA, LN, Ⅳ -C and PC Ⅲ levels, MMP-1 and the ratio of MMP-1/TIMP-1 increased significantly and level of TIMP-1 decreased significantly in Qishen Erlian Decoction groups, with statistical significance (P<0.05, P<0.01). And there is a certain dose-effect relationship, with Qishen Erlian Decoction high-dose group the best effect. Conclusion Qishen Erlian Decoction can improve the liver function and liver fibrosis indexes, regulate the level of MMP-1 and TIMP-1, and prevent the progression of liver fibrosis.

Key words: Qishen Erlian Decoction; liver fibrosis; extracellular matrix; MMP-1; TIMP-1; rats

基金项目：国家中医药管理局中医药科学技术研究专项（2016ZX05）；黑龙江省科技计划（GC12C120）；黑龙江省博士后科研

启动资助金（LBH-Q13156）

通讯作者：张雅丽，E-mail：113599895@qq.com

肝纤维化是在体内有害因素的持续刺激下，肝脏内弥漫性细胞外基质（ECM）的合成和降解失去平衡的一种病理变化，属于肝损伤后组织修复过程中的一种代偿反应，也是肝硬化发展的必经阶段。而基质金属蛋白酶类（MMPs）和金属蛋白酶抑制剂（TIMP）两者的平衡在 ECM 的合成与降解中发挥重要作用。有研究发现，通过对 MMPs/TIMPs 平衡的干预，可抑制 ECM 合成，促进其降解，故其已成为逆转肝纤维

化的重要方法[1]。芪参二莲汤为黑龙江省中医药科学院著名肝病专家张雅丽教授治疗肝纤维化经验方，具有益气扶正、活血解毒、化痰通络的功效。我们前期研究发现，芪参二莲汤可通过减轻炎性细胞因子对肝细胞的直接损伤，抑制炎症向肝细胞浸润，具有明显的抗炎、保肝及调节免疫的功能，对肝纤维化具有一

定拮抗作用[2-4]。为了进一步探究其对肝纤维的逆转作用，本实验采用硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）灌胃法制备肝纤维化模型，通过检测大鼠肝功能、肝纤维化指标，监测 ECM 代谢因子 MMP-1、TIMP-1水平及其比值变化，探讨芪参二莲汤对大鼠肝纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级 SD 大鼠 120 只，雄性，2 月龄，体质量

（200±20）g，黑龙江中医药大学实验动物中心，动

物合格证号[黑动字第]P00102005。饲养于黑龙江省中医药科学院实验动物中心，室温 18～25 ℃、相对湿度 50%～60%、人工 12 h昼夜循环照明环境，分笼饲养，自由摄食饮水。

1.2 药物

芪参二莲汤（黄芪15 g，茵陈蒿 10 g，虎杖 10 g，西洋参 10 g，半边莲 10 g，半枝莲 10 g，猫爪草 10 g，石见穿 10 g，女贞子 15 g，墨旱莲 15 g，五味子 15 g，甘草 15 g），上述饮片购自黑龙江省中医药科学院中药房，本院煎药室制备并浓缩；秋水仙碱片，昆明制药集团股份有限公司，0.5 mg/片，批号 201410213，用前研细粉过 100 目筛，用蒸馏水配成混悬液。TAA，上海麦克林生化科技有限公司，批号MFCD00008070。

1.3 主要试剂与仪器

丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司，批号 20142301、20141161 ；总胆红素（TBIL）试剂盒，上海荣盛生物药业有限公司，批号20140806107；γ-谷氨酰转酞酶（γ-GGT）检测试剂盒，桂林优利特医疗电子集团公司，批号 25120784；透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号 20100514；大鼠 MMP-1、TIMP-1 ELISA 试剂盒，美国 RapidBio Lab. Calabasas，批号分别为 13070822、

13070866；Masson 三色染色试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司，批号 20140514。石蜡切片机

（RM2145，德国 Leica），石蜡包埋机（EG1140，德国 Leica），荧光显微镜（DM1L，德国 Leica），酶标仪（Benchmark plus 型，美国 Bio RAD），全自动生化分析仪（日立 7600-020，日本 HITACHI），CO2培

养温箱（3949 型，美国 Forma Scientific）。

1.4 分组、造模与给药

大鼠适应性饲养1周后，按体质量随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组和芪参二莲汤低、中、高剂量组，每组 20 只。除正常组大鼠常规饲养外，余组大鼠采用 TAA 灌胃法制造肝纤维化模型[5-8]，隔日 1次，连续7 周。药物组按照秋水仙碱（0.105 g/kg）和芪参二莲汤低（5 g/kg）、中（10 g/kg）、高（15 g/kg）剂量灌胃给药，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃。给药体积均为8 mL/kg，每日 1次，连续5周。

1.5 标本制备

实验结束后，所有大鼠腹腔注射 3%戊巴比妥钠（1 mL/100 g）麻醉，静脉取血，静置，5000 r/min离心 7 min，收集血清，-80 ℃冰箱保存备用，于肝左叶距边缘 0.5 cm处取 2 块 1 cm×1 cm×0.5 cm 大小组织块。

1.6 指标检测

1.6.1 肝组织病理形态 HE 染色将肝组织切片经

二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、100%

乙醇Ⅰ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、

50%乙醇、蒸馏水、苏木素染液、盐酸乙醇溶液、清

水、清水、氨水溶液、伊红染液、蒸馏水、50%乙醇、

70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙

醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ后入通风橱封片。Masson 染色切片将肝组织脱蜡、

苏木素染、流水稍洗、1%盐酸乙醇分化、流水冲洗、

丽春红酸性品红液染、蒸馏水、1%磷钼酸水溶液、

2.5%亮绿液染色、1%冰醋酸、95%乙醇、100%二甲苯。镜下观察肝脏组织病理形态及肝损伤程度。

1.6.2 肝功能检测采用全自动生化分析仪，对血清 ALT、AST、TBIL、γ-GGT 进行检测。

1.6.3 肝纤维化指标检测放射免疫分析法检测血清 HA、LN、PCIII、Ⅳ-C 含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6.4 血清基质金属蛋白酶-1 及其抑制剂测定采用 ELISA 试剂盒及酶标仪测定大鼠血清 MMP-1、

TIMP-1 含量，取出 96孔板，设置标准品孔、空白孔、模型孔、秋水仙碱孔和芪参二莲汤低、中、高剂量孔，加入标准品50 μL预计的标准品浓度梯度；按照顺序在待测样本孔中加入待测样本10 μL，再加样本稀释液 40 μL，重复洗板 3次后加酶标工作液，然后按顺序每孔先加入显色剂A液 50 μL，再加入显色剂B液

50 μL，于 37 ℃恒温箱中避光显色15 min。用酶标仪检测。

1.7统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s表示，采用方差分析，组间两两比较用LSD 法检—验，等级资料多组独立样本用秩和检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2结果

2.1一般情况

正常组大鼠与芪参二莲汤高剂量组营养状况良好，饮食和体态正常，反应灵敏，眼光有神，皮毛密集伴有光泽，体质量自然增加。余各组大鼠一般情况差，饮食少，皮毛发黄黯淡无光，伴轻度脱毛，潮湿成缕，体形消瘦，反应迟钝，烦躁易激惹。实验过程中大鼠部分死亡，原因可能为灌胃损伤或对药物耐受性差异等，模型组大鼠死亡3只，秋水仙碱组和芪参二莲汤低、中剂量组各死亡2 只。

2.2芪参二莲汤对大鼠肝脏组织病理形态的影响

HE 染色结果显示，正常组大鼠肝组织的肝小叶完整，肝细胞排列整齐，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，无变性坏死，未见纤维组织增生；模型组小叶结构破坏，肝细胞索排列紊乱，肝细胞变性，分坏死，伴有炎性细胞浸润，纤维组织大量增生；给药组肝脏损伤程度均较模型组明显减轻，肝小叶结构破坏减轻，肝脏胶原纤维增生减轻，肝细胞水肿好，变性情况明显改善，炎细胞浸润减少，其中以参二莲汤高剂量组肝脏结构改善最为明显。结果图 1。

Masson 染色结果显示，正常组大鼠肝细胞索排列整齐，在汇管区与间质的小血管壁上少量蓝色的胶原纤维分布；模型组胶原纤维明显增多，多分布在汇管区和血管周围，形成纤维间隔，破坏肝小叶结构；各给药组均较模型组减轻，胶原纤维组织增生均有不同程度的减少，纤维化程度有明显好转，部分较细的蓝色纤维走行于血管周围，其中以芪参二莲汤高剂量组肝脏结构改善最为明显。结果见图2。

2.3 芪参二莲汤对模型大鼠血清肝功能的影响

与正常组比较，模型组 ALT、AST、γ-GGT、TBIL

水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清 ALT、AST、TBIL、γ-GGT 水平显著降低

（P＜0.05，P＜0.01），其中以芪参二莲汤高剂量组疗

效最佳（P＜0.01）。结果见表 1。

3 讨论

中医学认为，肝纤维化属“积聚”“癥瘕”范畴，其病机为络气不足，气虚血瘀，外感湿热久羁，凝聚成痰，发为本病证。故肝纤维化多为本虚标实，虚实夹杂。芪参二莲汤用药以益气扶正为主，兼以解毒化痰逐瘀。本方重用黄芪，其为补药之长，气充帅血，祛瘀散结；西洋参、五味子、墨旱莲、女贞子滋补肝肾、活血通络，养血以柔肝体；半边莲、半枝莲清利湿热；石见穿、猫爪草化痰散结，解毒化瘀；茵陈蒿、虎杖、甘草散瘀退黄，清血分肝络之毒。综观全方，扶正祛邪，扶正不助邪，逐瘀与化痰并行，共奏益气扶正、活血解毒、化痰通络之功。

本课题结合肝脏组织病理学、肝功能、肝纤维化四项检测，对芪参二莲汤治疗肝纤维化的疗效进行研究，通过 HE 与 Masson 染色联合对照观察。结果显示，正常组大鼠肝脏组织均无明显异常改变；模型组肝小叶结构破坏，肝细胞索排列紊乱，肝细胞变性，部分肝细胞坏死，伴有中性粒细胞及淋巴细胞浸润，

纤维组织大量增生，个别大鼠可见假小叶形成；各给药组肝脏损伤程度均较模型组减轻，而且芪参二莲汤能够明显改善肝纤维化大鼠 ALT、AST、TBIL、γ-GGT及HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平，其中以芪参二莲汤高剂量组疗效最佳。

肝脏的ECM过度沉积形成肝纤维化，而ECM 在肝内过度沉积不仅仅是由于 ECM 合成增多，更大程度上是由于 ECM 降解减少[9]。然而，机体主要是通过MMPs与 TIMPs的动态平衡来调节ECM的生成和

降解，MMP-1能降解纤维化肝组织中ECM的主要成分Ⅰ、Ⅲ型胶原，而 ECM 主要是Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉

积[10]。TIMP-1 可抑制 MMP-1 的活性，导致ECM 降解减少。当 MMP-1 和 TIMP-1 比例失调时，导致胶原酶活性减弱，使肝组织内胶原代谢紊乱，Ⅰ、Ⅲ型胶原降解减少而沉积，造成肝纤维化的进一步恶

化[11]。史玉岭[12]使用 ROC 曲线评估 TIMP-1 诊断肝纤维化的敏感度、特异性，结果显示其明显高于肝纤维化标志物 HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN，提示血清 TIMP-1诊断肝纤维化有较高的敏感度和特异性，其水平反映肝纤维化程度。本研究结果显示，TAA诱导肝纤维化模型大鼠较正常组大鼠血清 MMP-1 水平明显降低，

TIMP-1 较正常组明显升高，MMP-1/TIMP-1 较正常组明显降低，与近年来肝纤维化形成过程中有关MMPs 与 TIMPs 表达的相关研究结果一致[13]。而芪参二莲汤能显著提高 MMP-1 水平，降低 TIMP-1 水平，从而调整 MMP-1/TIMP-1 的平衡，达到逆转肝纤维化的目的。

综上，芪参二莲汤能明显改善肝纤维化大鼠肝功能及肝纤维化指标，促进 MMP-1/TIMP-1 平衡，从而达到防治肝纤维化的作用，且存在一定的量效关系。

参考文献：

[1] WATANABE T, NIIOKA M, HOZAWA S, et al. Gene expression of interstitial collagenase in both progressive and recovery phaseofrat liver fibrosis induced by carbon tetrachloride[J]. J

Hepatol,2000,33(2)：224-235.

[2] 王炳予,袁星星,张雅丽.芪参二莲汤治疗基因Ⅰ型高病毒载量慢性丙

型肝炎临床疗效观察[J].中西医结合肝病杂志,2015,25(4)：222-223.

[3] 张雅丽,袁星星,杨磊,等.芪参二莲汤联合恩替卡韦对慢性乙型病毒

性肝炎病毒应答及免疫影响的临床观察[J].上海中医药杂志,2015,

49(12)：35-38.

[4] 王炳予,袁星星,张雅丽.芪参二莲汤加聚乙二醇干扰素α-2a 联合利巴韦林治疗 1b 型慢性丙型肝炎疗效观察[J].中西医结合肝病杂志,

2014,24(4)：217-219,238.

[5] 薛改,刘建芳,闫成,等.硫代乙酰胺诱导大鼠持久性肝纤维化模型的

制备[J].世界华人消化杂志,2015,23(12)：1937-1942.

[6] BRUCK R, HERSHKOVIZ R, LIDER O, et al. Inhibition of experimentally-induced liver cirrhosis in rats by a nonpeptidic mimetic of the extracellular matrix-associated Arg-GlyAsp epitope[J]. J Hepatol,1996,24(6)：731-738.

[7] GENG J, PENG W, HUANG Y, et al. Ginsenoside-Rg1 from Panax notoginseng prevents hepatic fibrosis induced by thioacetamide in rats[J]. Eur J Pharmacol,2010,634(s1/3)：162-169.

[8] OKUYAMA H, NAKAMURA H, SHIMAHARA Y, et al. Overexpression of thioredoxin prevents thioacetamide-induced hepatic fibrosis in mice[J]. J Hepatol,2005,42(1)：117-123.

[9] 帅峰.中药小柴胡汤对肝纤维化大鼠 MMPs 与 TIMPs mRNA 的影响[J].

安徽医药,2009,13(2)：139-141.

[10] 魏晓龙,蒋明德,曾维政,等.MMP-1 过表达的骨髓间充质干细胞对肝

纤维化的修复作用[J].中南大学学报,2014,39(3)：258-264.

[11] 段志军,李吉彦,丛振日,等.益气软肝法对肝纤维化大鼠肝组织

MMP-1/TIMP-1 活性的影响[J].中国中医基础医学杂志,2002,8(9)：3234.

[12] 史玉岭.基质金属蛋白酶抑制剂-1 在肝纤维化诊断中的临床应用[J].中国医学创新,2012,9(23)：87-89.

[13] LIMURO Y, BRENNER D A. Matrix metalloproteinase gene delivery for liver fibrosis[J]. Pharrn Res,2008,25(2)：249-258.

（收稿日期：2016-06-13）

（修回日期：2016-06-23；编辑：华强）