CJI (Traditional Chinese Medicine)
颊针对类风湿关节炎家兔血浆代谢物表达的影响
颉旺军，蒲瑞生，方晓丽，刘丁龙，权可，秦晓光，苏成红
甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000
摘要：目的 观察颊针和体针对类风湿关节炎模型家兔血浆代谢组学的影响，探寻与颊针和体针作用机制有关的代谢物。方法 选取大耳白兔16只，采用完全弗氏佐剂诱导类风湿关节炎模型，造模后颊针组取颊针“膝”穴，用13 mm×0.32 mm毫针直刺 0.2～0.5 mm，捻转为主，穴位刺激15 s，每日 1次。体针组选取“膝眼”“足三里”，用 13 mm×0.32 mm毫针直刺2～3 mm，每隔5 min 行针 1次，采用捻转针法，100 次/min，行针 15 s，每日 1次。连续治疗5 d后应用 UPLC-QTOF/MS检测各组血浆代谢物，采用相似度分析、系统聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行研究，通过载荷分析确定有意义的代谢物。结果 相似度分析、HCA及 PCA均表明体针组、颊针组、模型组及正常组血浆样品中内源性代谢物存在显著差异；OPLS-DA能将 4组不同处理家兔血浆样品代谢物在三维象限中完全分开，且各自样品均聚集在一起；载荷分析表明，颊针组与模型组、体针组与模型组间 19 种内源性代谢物差异有统计学意义；颊针组苯丙氨酸和酪氨酸代谢中 N-乙酰-L-苯丙氨酸及 2-苯基丙酸均显著下调，而体针组则显著上调。结论 颊针和体针治疗类风湿关节炎的机理有一定相似性，但也存在差异，N-乙酰-L-苯丙氨酸及 2-苯基丙酸是其差异的主要潜在生物标志物。关键词：颊针；体针；类风湿关节炎；液相色谱-质谱联用；代谢组学；兔
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.014
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2017)05-0057-06
Effects of Buccal Acupuncture on Expression of Plasma Metabolites Spectrum of Rabbits with Rheumatoid Arthritis
JIE Wang-jun, PU Rui-sheng, FANG Xiao-li, LIU Ding-long, QUAN Ke, QIN Xiao-guang, SU Cheng-hong (Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)
Abstract: Objective To observe the effects of buccal acupuncture therapy and body acupuncture therapy on plasma metabolomites of rheumatoid arthritis rabbits model; To search for the metabolites related to the mechanism of buccal acupuncture and body acupuncture. Methods Sixteen rabbits were made into rheumatoid arthritis models by complete freund’s adjuvant before the treatment. The buccal acupuncture group was treated by buccal acupuncture on the “knee” acupoint; 13 mm × 0.32 mm needle straight 0.2–0.5 mm, twist the main points of stimulation 15 s, once a day. The body acupuncture group was treated by body acupuncture on the “Xiyan” and “Zusanli” acupoints; with 13 mm × 0.32 mm needle straight 2–3 mm, every 5 min each time, twisting needle method, 100 times/min for 15 s, once a day. After the continuous treatment for 5 days, UPLC-QTOF/MS was applied to test metabolite from the plasma sample of all groups. Similarity analysis, hierarchical cluster analysis (HCA), principal component analysis (PCA), orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) were applied in this research; meanwhile load analysis method was used to identify the meaningful metabolites. Results The similarity analysis, HCA and PCA all showed the significant difference of endogenous metabolites in plasma samples among the buccal acupuncture group, the body acupuncture, the model group and the blank group. The 4 groups of different plasma sample metabolite were completely separated in three dimensions by OPLS-DA and all the samples were gathered respectively. The load analysis indicated that there were 19 kinds of endogenous metabolites which showed the significant differences between buccal acupuncture group and model group, and also happened between the body acupuncture group and the model group; N-cetyl-L-phenylalanine and 2-phenyl propionate in metabolism of
phenylalanine and tyrosine decreased significantly in the buccal acupuncture group while significantly increased in the body acupuncture group. Conclusion There are relative similarity on the mechanism of treating rheumatoid arthritis between buccal acupuncture and body acupuncture. However, N-acetyl-L-phenylalanine and 2-phenyl propionate, as the main potential biomarkers of the difference, indicate that the dissimilarity can be significant.
Key words: buccal acupuncture; body acupuncture; rheumatoid arthritis; LC-MS; metabolomics; rabbits
颊针是通过针刺面颊部的特定穴位达到治疗目的的一种方法，其有效性已被大量临床实践所证实，尤其对疼痛性疾病的临床效果尤为明显，即时止痛有效率达 72.5%[1]。研究表明，颊针即时镇痛效应优于体针，其中枢镇痛作用的机制可能是促使脑脊液中β内啡肽含量升高和 8-肽胆囊收缩素含量向正常水平
恢复[2]。但目前的研究仍以少数常规的神经递质含量变化为指标，未能对机体整体代谢进行系统研究。代谢组学是对生物体因病理、生理刺激或基因改变等所致动态多参数代谢应答的定性定量研究，其研究对象更接近生物表型，已成为系统生物学的重要支撑学科
之一[3]。此外，代谢组学所强调的“系统观”“整体观”与中医思维不谋而合，其与 UPLC-QTOF/MS、核磁共振 [4]、气相色谱-质谱联用[5]等高灵敏度、强分辨率、快速分离分析的现代仪器分析平台相结合，能够为中
医药现代化研究提供重要的技术窗口[6]。本研究引入基于 UPLC-QTOF/MS 的代谢组学方法，观察颊针和体针对类风湿关节炎（RA）模型家兔血浆代谢组学的影响，探寻与颊针和体针作用机制有关的代谢物。
1 材料与方法 1.1 试剂
乙腈（色谱纯，德国 Merck 公司），甲酸（色谱纯，德国 Merck 公司），亮氨酸脑啡肽（美国 Sigma公司），甲醇（色谱纯，山东禹王试剂公司），超纯水（自制），卵蛋白干粉（美国Sigma公司，批号A5253），弗氏完全佐剂（美国 Sigma 公司，批号 F-5881）。
1.2 仪器
Waters Acquity UPLC 超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；Xevo G2 QTOF四级杆飞行时间串联质谱仪（美国 Waters 公司），配有ESI（电喷雾离子源）和 Masslynx V 4.2 化学工作站；XW-80A旋涡混合器（上海精密仪器有限公司）；微机控制高速冷冻离心机及 L-500 型低速离心机（湘仪仪器有限公司）；超纯水制水机（0.22 μm过滤器，美国 Millipore 公司）。
1.3 动物及分组
健康日本大耳白兔16 只，雌雄各半，6～8月龄，体质量（2.0±0.25）kg，兰州陆军总院实验动物中心。饲养于兰州陆军总医院实验动物中心，实验室温度
25 ℃、湿度 50%～55%。将 16只家兔随机分为正常组（ZC）、模型组（MX）、体针组（TZ）和颊针组（JZ），每组 4 只，分别编号为 ZC1～ZC4、MX1～MX4、
TZ1～TZ4 及 JZ1～JZ4。
1.4 造模
参考文献[7]方法，将卵蛋白干粉按 4 mg/mL 与等量弗氏完全佐剂混匀，充分震荡15 min，待两者成乳白色胶状液体即成乳化剂，然后用宠物电推剪去兔背部和双膝关节的毛，在模型组、颊针组、体针组家兔肩背部选6个位点，每点皮下注射该溶液0.2 mL，
2周后以相同剂量重复皮内注射1 次。第 2次免疫后
6 d，在兔双膝关节内分别注入卵蛋白生理盐水溶液
0.4 mL，浓度为 20 mg/mL。1 周后观察到兔进食量减少、活动减少，双侧膝关节肿胀，测定痛阈明显降低，表明造模成功。正常组不造模，但在相应部位、时间注射等量生理盐水。
1.5 针刺方法
1.5.1 穴位选择 颊针组取颊针“膝”穴[8]。参照人颊针“膝”穴定位标准并以比较解剖学为依据定位，髋（颊车）与承浆连线的中点处。体针组选取膝眼、
足三里，家兔穴位定位参照《实验针灸学》[9]类比取穴。“膝眼”：胫骨内外侧1 cm。“足三里”：小腿背外侧上 1/5折点处，约当腓骨小头下1.2 cm、胫骨后1 cm处。
1.5.2 处理方法 正常组：于实验第27 日开始，每日用与其他组相同方法固定 30 min；模型组同正常组；体针组：于实验第 27 日开始，选双侧后肢“膝眼”和“足三里”，用华佗牌13 mm×0.32 mm毫针，直刺 2～3 mm，每隔 5 min 行针1次，采用捻转针法，
100 次/min，行针 15 s，每日 1次，连续针刺5 d；颊针组：于实验第 27 日开始，选颊针“膝”穴治疗，用 13 mm×0.32 mm毫针直刺 0.2～0.5 mm，捻转为主，穴位刺激15 s，每日 1次，连续针刺5 d。
1.6 血浆样本收集及保存
连续针刺5d，抽取静脉血1 mL，EDTA 抗凝， 3000 r/min 离心 15 min，-20 ℃冷冻保存。
1.7 待测样品储备液方法
将保存的血浆自然解冻，以90%乙腈进行沉淀，
3000 r/min 离心 10 min，取上清液，重复 3次。混合上清液，在液体快速混合器中混匀30 s，12 000 r/min离心 3 min，取上清液，以甲醇定容于25 mL容量瓶中，即得。
1.8 检测条件
1.8.1 色谱条件 Waters Acquity BEH C18 色谱柱
（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：A相为 0.1%甲酸水溶液，B 相为乙腈；梯度洗脱程序见表 1；流
速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃[10]。
1.8.2 质谱条件 离子源：ESI+；锥孔电压：45 V；
毛细管电压：3.5 kV；离子源温度：110 ℃；脱溶剂
气温度：330 ℃；锥孔气流量：50 L/h；脱溶剂气流
量：600 L/h；萃取锥孔：4.0 V；每 0.2 s 采集1次；扫描范围： 100 ～ 1000 m/z ；以亮氨酸-脑啡肽溶
液[M+H]+＝556.277 1 Da作为锁定质量。
1.9 数据处理与模型建立方法
采用 MasslynxV4.2 软件进行峰识别、峰对齐和基线矫正等前处理，三维总离子流（TIC）色谱叠加图绘制及相似度计算均采用 Matlab6.5 软件，系统聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判别分析（OPLA-DA）等模型采用SIMCA-P12.0 软件建立。
2 结果
2.1 血浆样品 UPLC-QTOF/MS 分析
本研究以指认出的峰个数及总信号强度为指标，通过对色谱、质谱检测条优化，以选定方法对 16 份血浆样品进行分离分析。为方便比较，将 16 份血浆样品的 TIC色谱图绘制在同一个三维坐标中，见图1。可知，UPLC-QTOF/MS 在一个分析流程内可同时检测到家兔体内多种不同的内源性代谢物。直观分析可知，不同组家兔血浆样品的TIC色谱图在保留时间、峰高低及峰个数均具有一定差异。但直观分析难以对不同组样品 TIC色谱图的差异进行量化的精确表达， 故本研究对 16份血浆样品TIC 色谱图进行相似度分析[11]。
2.2 血浆样品色谱图相似度分析
本研究分别以 16 份血浆样品 TIC 色谱图的均谱即 TIC色谱图共有模式）、正常组4份血浆样品TIC色谱图的均谱及模型组4份血浆样品TIC色谱图的均谱作为对照图谱，采用“CORREL 函数”计算 16 份血浆样品 TIC 色谱图与3种对照图谱的相似度，3种相似度分别以 S1、S2 及 S3 表示，见表2。可以看出，除 JZ1 相似度 S1、S2 和 JZ3 相似度 S2、S3 接近 0.9
外，其余相似度均＞0.9，说明不同处理组家兔血浆样品 TIC色谱图非常相近，即不同处理组家兔血浆内源性代谢物种类及含量较为相近。
但是，不同处理组的家兔血浆样品TIC 色谱图3种相似度也表现出明显的特点。首先，正常组4 份家兔血浆样品均与正常组样品 TIC 色谱图的均谱相似
度（S2）最大，而模型组4份家兔血浆样品均与模型组样品 TIC色谱图的均谱相似度（S3）最大，这说明未给予针刺家兔血浆中内源性代谢物变化不显著。其次，体针组与颊针组血浆样品均较正常组与模型组血浆样品的3种相似度小，这说明RA模型家兔给予针刺后，其血浆中内源性代谢物发生了变化。
2.3 血浆样品色谱图系统聚类分析
为了对血浆样品 TIC 色谱图相似度分析的结果进行验证，本研究以 TIC 色谱的峰强度为变量，对
6 份血浆样品 TIC 色谱数据进行HCA。聚类采用欧氏距离（Euclidean distance）系数，以类间平均链锁
Within-groups linkage）法进行聚类[12]，见图 2。可知，在欧氏距离为 20 以内，16 份血浆样品可聚为 4
类，第Ⅰ、Ⅱ类分别为模型组与正常组血浆样品，2组样品可根据TIC色谱图被聚为完全不同的2 类；第Ⅲ类为体针组血浆样品，但颊针组样品JZ4 也被聚在
了第Ⅲ类，但在欧氏距离为20以内，颊针组样品JZ4未与第Ⅲ类聚在一起；第Ⅳ类为颊针组血浆样品。上述分析表明，模型组、正常组、体针组及颊针组血浆样品 TIC色谱图存在显著差异。
.4 血浆样品代谢物主成分分析
为了考察模型组、正常组、体针组及颊针组家兔浆样品代谢物的变化规律，本研究采用 PCA 对 4家兔血浆 TIC 代谢谱数据进行模式识别[13]。PCA提取出特征根＞1的 2个主成分，包含了TIC 代谢数据84.27%的信息量，PCA二维模式投影图见图3。知，在较大的二维空间内4组家兔血浆样品代谢物明显区别，但在较小的二维空间内基本可区分。这明 PCA 难以精准地对不同组别家兔血浆中内源性谢物的变化差异进行放大与区别，因此不能分析 4组家兔不同处理后代谢物变化的生物标志物。
2.5血浆样品代谢物正交偏最小二乘判别分析
OPLS-DA能够先对UPLC-QTOF/MS信号进正交信号校正，对影响偏最小二乘分析的“脏数据”信号进行剔除，便于找出4组不同处理家兔血浆样品的代
谢物的区别及其生物标志物[14]。以参数R2Y（表示模型的拟合程度）及Q2（表示模型的可预测程度）考察模型的有效性，本研究所建模型的 R2Y 和 Q2分别为
0.943 4 和 0.843 5，表明该模型较为可靠。OPLS-DA的三维模式投影图及载荷图分别见图4、图 5。由图 4可知，基于 OPLS-DA 模型，4 组不同处理家兔血浆样品代谢物在三维象限中完全分开，且模型组、正常组、体针组及颊针组各自4份样品都聚集在一起，说明 4组间血浆样品代谢物差异有统计学意义，造成这种差异的代谢物即为潜在的生物标志物。
潜在生物标志物的选择可通过 OPLS-DA 模型的载荷图进行鉴定与分析。OPLS-DA 载荷图表明了变量（波数）对样本分类贡献的大小，距离原点越远对分离贡献越大。潜在生物标志物的鉴定方法：首先确定潜在标志物的准分子离子峰，再根据准确的分子质量结合分子式预测工具来预测化合物的元素组成，然后利用文献及 MassBank、ChemSpider 及 MetFrag 数
据库进行检索，初步确认候选代谢物[15]。本研究代谢产物路径分析采用 metPA 网络软件执行。
采用上述鉴定方法对家兔血浆中重要的代谢物进行推断，共鉴定出 19 种代谢物，对其 2 种针刺法处理前后 2 组家兔间及 2 种针刺法间差异进行 t 检
验[16]，结果见表3。其中，甲基组氨酸、尿苷、肌酸酐、瓜氨酸、偏苯三酚、黄嘌呤、羟苯基甘氨酸、喹
哪啶酸、4-羟基醌、哌啶及喹啉在颊针和体针处理后均显著上调，泛酸、苯甲酰氨基酯酸、生物素酰胺、
壬二酸、吲哚-3-羧酸及4-吡哆酸在颊针和体针处理后均显著下调，N-乙酰-L-苯丙氨酸和 2-苯基丙酸均为颊针处理后显著下调而体针处理后显著上调。这些发生变化的代谢物预示着RA模型家兔在针刺后体内多个代谢通路发生变化，包括嘧啶代谢、嘌呤代谢、脂肪酸代谢、维生素B6代谢、泛酸和辅酶A生物合成及多种氨基酸代谢。除甲基组氨酸、泛酸、壬二酸、
吲哚-3-羧酸外，其余代谢物颊针组和体针组比较，差
异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。
3 讨论
为获取更为全面和稳定的代谢物检测谱图，本研究以检测峰数和总信号强度作为评价指标，对血浆样品的前处理方法、质谱条件及流动相均进行了优化，并进行了方法学验证。实验比较了甲醇、乙腈2 种常用的有机溶剂处理血浆样品的方法，结果表明，当乙腈达到90%（V/V）时，不但沉淀蛋白的效果充分、均匀，同时又保证了检测的信息量。因为血浆样品成分复杂，m/z 较小的碎片信号强度较大，容易对有用 信息造成干扰，故采用m/z 范围在 100～1000 的正离子全扫描模式，以提高有用信号的信噪比。血浆样本的代谢组学通常使用乙腈-水体系进行分析，但弱酸性条件有利于ESI+模式下样品的离子化，故本实验流动相采用 0.1%甲酸水溶液作为 A 相，并优选了不同洗脱梯度。方法学考察显示，本实验仪器精密度、血浆样品稳定性及实验重复性等均符合要求。
PCA是一种非监督性学习方法，多用于初步分析不同组样本间总体分布状况、自然聚集状态的差异以
及判断有无奇异样本等，其对不同组样品的鉴别、分组能力不如有监督的多维模式识别方法，如 PLS-DA及 OPLS-DA[17]。OPLS-DA 是 PLS-DA 经过正交矫正后的衍生算法。与 PCA 及 PLS-DA 相比，OPLS-DA能最大化地凸显模型内部不同组间的差异，达到最好区分不同处理组样品的效果[18]。本研究结果表明，基于 OPLS-DA 模型，4 组不同处理家兔血浆样品代谢物在三维象限中完全分开，分类效果明显优于 PCA模型，使分析4组家兔不同处理后代谢物变化的生物标志物及相关代谢通路更加可行和科学。
颊针基于现代生物全息论，是针灸学中微针诊疗系统的一个新分支。经临床验证，颊针疗效稳定、可靠，对疼痛性病症效果尤为明显，且对黄种人、黑种人及白种人均有效，具有取穴方便、操作简单、止疼效果迅速、适应症及适应人群广泛等优点，便于学习掌握、推广应用。本研究初步揭示了颊针和体针对RA 模型家兔血浆代谢组学影响的共同点及不同点，发现2种针刺方法对RA模型家兔血浆代谢物影响的变化趋势基本一致，但2种不同针刺处理组模型家兔之间血浆代谢物的变化具有显著差异。两者最显著的差异表现为苯丙氨酸和酪氨酸代谢中 N-乙酰-L-苯丙氨酸及2-苯基丙酸的变化趋势完全相反，颊针组2种代谢物均显著下调，而体针组则显著上调，说明颊针和体针对RA的治疗机理可能不同。
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（收稿日期：2016-06-21）
（修回日期：2016-08-25；编辑：华强）