HPLC同时测定盆炎净胶囊中3种有效成分含量

袁志鹰1，杨岩涛 1，李荣东 1，李哲 1，欧阳吉德 2

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.郴州市食品药品检验所，湖南 郴州 423000摘要：目的 建立 HPLC 同时测定盆炎净胶囊中 3 种有效成分芍药苷、原儿茶酸和绿原酸的含量分析方法。方法 采用 SHIMADZU VP-ODS-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相为乙腈-0.15%磷酸溶液梯度洗脱，检测波长 231、255、326 nm，流速 1.0 mL/min，柱温 30 ℃，进样量20 µL。结果 在上述色谱条件下，芍药苷、原儿茶酸、绿原酸之间分离度良好。芍药苷Y＝1546.412 8X＋127.075 6（r＝0.999 9），线性范围 150.054～1254.50 ng；原儿茶酸 Y＝2925.846 8X＋2204.107 6（r＝0.999 8），线性范围 162.33～1352.75 ng；绿原酸 Y＝893.904 5X－261.731 5（r＝0.999 4），线性范围 11.43～95.25 ng。3 种成分的平均回收率分别为

97.60%、102.09%、98.52%。结论 该方法操作简单、方便、准确，可为盆炎净胶囊的质量控制提供借鉴。关键词：盆炎净胶囊；芍药苷；原儿茶酸；绿原酸；高效液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.019

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2017)05-0082-04

Simultaneous Contents Determination of Three Active Ingredients in Penyanjing Capsules

by HPLC YUAN Zhi-ying1, YANG Yan-tao1, LI Rong-dong1, LI Zhe1, OUYANG Ji-de2 (1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. Chenzhou Institute for Food and Drug Control, Chenzhou 423000, China)

Abstract: Objective To establish an HPLC method for simultaneous contents determination of paeoniflorin, protocatechuic acid and chlorogenic acid in Penyanjing Capsule. Methods The chromatographic separation was performed on a SHIMADZU VP-ODS-C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm); the column temperature was maintained at 30 ℃; A gradient elution of acetonitrile-0.15% phosphoric acid aqueous solution was adopted at the flow rate of 1.0 mL/min; The UV detection wavelengths were at 231, 255, and 326 nm; The injection volume was 20 µL. Results Paeoniflorin, protocatechuic acid and chlorogenic acid could be separated efficiently with this condition. The regression equation was Y=1546.412 8X+127.075 6 (r=0.999 9), Y=2925.846 8X+2204.107 6 (r=0.999 8),

Y=893.904 5X－261.731 5 (r=0.999 4), respectively. Paeoniflorin, protocatechuic acid and chlorogenic acid were linear in the range of 150.054–1254.50 ng, 162.33–1352.75 ng, 11.43–95.25 ng, and the average recoveries were

97.60%, 102.09% and 98.52%. Conclusion The method is simple, convenient and accurate, which can be used to the quality control of Penyanjing Capsule.

Key words: Penyanjing Capsule; paeoniflorin; protocatechuic acid; chlorogenic acid; HPLC

盆炎净胶囊是在盆炎净颗粒（卫生部药品标准WS3-B-2387-97）的基础上改变剂型而成，由忍冬藤、蒲公英、鸡血藤、益母草、狗脊、车前草、赤芍、川芎共 8味药组成，具有清热利湿、和血通络、调经止带之功效，适用于湿热下注、白带过多等妇科带下病，

基金项目：湖南省自然科学基金（13JJ5032）；湖南省教育厅

优秀青年项目（15B172）；湖南省中医药管理局科研项目

（201494）；湖南中医药大学青年教师科研基金（2015-13）；

湖南中医药大学中药技能大学生创新实验项目（201603）

通讯作者：杨岩涛，E-mail：xdyyt1@163.com

是临床常用中成药之一，疗效确切[1]，且未见明显不良反应。但现有质量标准（国家食品药品监督管理局标准 YBZ23722005）较为简单，只有部分药材的薄层定性鉴别，难以整体控制药品质量。芍药苷为赤芍的

定量指标成分[2]；君药忍冬藤和蒲公英具有较强的抗

菌作用，其抗菌有效成分以绿原酸为主[3]；原儿茶酸是忍冬藤、鸡血藤、狗脊、川芎、车前草等多种药材

中的主要活性成分[4-8]。以上 3 种成分均具有较强的生理活性。采用 HPLC 单独测定芍药苷[9-10]、原儿茶

酸[11]、绿原酸[3]含量的方法均已建立，但尚无同时测定 3种成分含量的方法。因此，为全面控制盆炎净胶

囊质量，提高分析检测效率，本研究尝试建立同时测定芍药苷、原儿茶酸、绿原酸3种主要药效活性物质含量的 HPLC 方法。

1 仪器与试药

岛津 LC-20A 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），岛津 SPD-M20A 二极管阵列 DAD 检测器，

SIL-20A 自动进样器，METTLER TOLEDO ML204 电子分析天平（瑞士 METTLER TOLEDO 公司），

KQ-300DE超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。芍药苷对照品（批号 110736-201539）、原儿茶酸对照品（批号 110809- 201205）、绿原酸对照品（批号

110753-201415），中国食品药品检定研究院。盆炎净胶囊（湖南东润联合制药有限公司，批号分别为

20140302、20140415、20151221、20150524、20151213、

20141105、20150126）；乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为 SHIMADZU VP-ODS-C18（250 mm×

4.6 mm，5 µm）；流动相 A为乙腈，B为 0.15%磷酸溶液，梯度洗脱（见表 1）；流速：1.0 mL/min；波长：

231、255、326 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 µL。

2.2 对照品溶液制备

精密称定芍药苷、原儿茶酸和绿原酸对照品适量，置于同一量瓶中，加乙腈溶解稀释，制成每1 mL含芍药苷 250.90 µg、原儿茶酸 270.55 µg 和绿原酸19.05 µg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取盆炎净胶囊内容物约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇 25 mL，称定质量，超声提取（功率 300 W，频率 40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，滤液过微孔滤膜（0.45 µm），取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液制备

忍冬藤、蒲公英、鸡血藤、狗脊、车前草、赤芍、川芎中均含有芍药苷、原儿茶酸和绿原酸3种有效成 分中的1种或多种，故按处方配比制成只有益母草（缺忍冬藤、蒲公英、鸡血藤、狗脊、车前草、赤芍、川芎）的阴性样品，按“2.3”项下方法制备，即得。

2.5 专属性试验及系统适用性试验

在“2.1”项色谱条件下，混合对照品与供试品溶液中 3种有效成分达到基线分离，色谱图见图1。芍药苷、原儿茶酸、绿原酸各色谱峰与相邻色谱峰的分

离度均＞1.5，理论塔板数按芍药苷峰计均＞3000。

2.6 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液 300、500、1000、1500、

000、2500 µL，分别置于 10 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。在上述色谱条件下，吸取各浓度混合对照品溶液20 µL注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，混合对照品进样量（ng）为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方

程：芍药苷（λ＝231 nm）Y＝1546.412 8X＋127.075 6

r＝0.999 9），线性范围 150.054～1254.50 ng；原儿

茶酸（λ＝255 nm）Y＝2925.846 8X＋2204.107 6（r＝

0.999 8），线性范围 162.33～1352.75 ng；绿原酸（λ＝

326 nm）Y＝893.904 5X－261.731 5（r＝0.999 4），线性范围 11.43～95.25 ng。

2.7 精密度考察

取同一对照品溶液20 µL，连续进样 5次，记录色谱峰峰面积，芍药苷、原儿茶酸和绿原酸色谱峰峰面积的 RSD 分别为 0.7%、0.4%、0.5%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

按“2.3”项下方法重复制备 5份同一批号的供试品溶液，分别进行测定，记录色谱峰峰面积，芍药苷、原儿茶酸和绿原酸色谱峰峰面积的 RSD 分别为

1.5%、1.3%、1.9%。表明本方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液20 µL，在上述色谱条件下，分别在 0、2、4、6、12 h进样测定，记录色谱峰峰面积，芍药苷、原儿茶酸和绿原酸色谱峰峰面积的 RSD 分别为 1.3%、1.0%、1.2%。表明 3种有效成分在 12 h内稳定。

2.10 加样回收试验

精密称取已知含量的盆炎净胶囊样品6份（每份内容物 0.1 g），精密加入 2.0 mL混合对照品溶液（相当于芍药苷 501.80 µg、原儿茶酸 541.10 µg、绿原酸

38.10 µg），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件进行测定，经计算，加样回收率分别为 97.60%、102.09%、98.52%，RSD 分别为 1.39%、

1.53%、1.12%，表明回收率良好。结果见表 2。

2.11 样品测定

分别精密称取 10 份不同批号的盆炎净胶囊，每份约 0.2 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，各被测组分与共存组分实现基线分离，采用外标法计算样品中各成分的含量，结果见表3。

3讨论

本试验根据芍药苷、原儿茶酸和绿原酸的性质，对供试品溶液的制备方法进行了条件筛选。提取溶剂

比较了纯甲醇、75%甲醇、50%甲醇、95%乙醇、75%

乙醇、50%乙醇、水等的提取效果，结果表明，甲醇提取效果比乙醇好，而甲醇3个浓度的提取效果相近，考虑到成本，选定50%甲醇作为提取溶剂；提取方式比较了超声和回流对提取效果的影响，结果显示，超声提取效率优于回流提取；提取时间比较了超声15、

30、60 min对测定结果的影响，结果显示，超声提取

30、60 min的效果相近，均明显优于15 min 提取效果，综合能量消耗及生产效率等因素，选定提取时间

30 min。因此，最终选择50%甲醇作为提取溶剂，超声提取 30 min制备供试品溶液。

本试验对色谱条件进行优选，采用二极管阵列检测器在波长 200～400 nm范围内扫描，发现芍药苷在

231 nm、原儿茶酸在 255 nm、绿原酸在 326 nm处有最大吸收，为提高分析方法的灵敏度，减少干扰，本研究采用多波长检测方法；考察不同色谱柱 Agilent ZORBAX SB-C18 （ 250 mm × 4.6 mm ， 5 µm ）、Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）和 SHIMADZU VP-ODS-C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）的峰形、柱效和分离度，结果显示，以 SHIMADZU

VP-ODS-C18 为最佳；试验比较了乙腈-水、乙腈0.15%磷酸、甲醇-水、甲醇-0.15%磷酸等不同比例的

流动相系统进行梯度洗脱，结果表明，以乙腈-0.15%磷酸为流动相梯度洗脱，基线平稳，供试品各成分峰保留时间适中，分离度和峰形最佳。最终优选色谱条

件为：SHIMADZU VP-ODS-C18 色谱柱（4.6 mm×

250 mm，5 µm），流动相为乙腈-0.15%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速 1.0 mL/min，检测波长分别为 231、

255、326 nm，柱温 30 ℃。在此条件下，基线平稳，分离效果好，因此所建立的方法能同时准确测定芍药苷、原儿茶酸和绿原酸的含量。

对盆炎净胶囊样品的测定结果表明，7 个批次中均含有芍药苷、原儿茶酸和绿原酸，其中芍药苷和原儿茶酸含量比绿原酸高，但不同批次样品的3种成分含量有一定的差异，可能与药材及工艺流程有关，需进一步探讨。本研究建立了同时测定盆炎净胶囊中芍药苷、原儿茶酸和绿原酸含量的分析方法，方法简单、方便、准确，可为盆炎净胶囊、盆炎净颗粒及相关药材的质量控制提供借鉴。

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（收稿日期：2016-06-14）

（修回日期：2016-07-14；编辑：陈静）