HPLC同时测定盆炎净胶囊中3种有效成分含量

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

袁志鹰1,杨岩涛 1,李荣东 1,李哲 1,欧阳吉德 2

1.湖南中医药大学,湖南 长沙 410208;2.郴州市食品药品检验所,湖南 郴州 423000摘要:目的 建立 HPLC 同时测定盆炎净胶囊中 3 种有效成分芍药苷、原儿茶酸和绿原酸的含量分析方法。方法 采用 SHIMADZU VP-ODS-C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 µm),流动相为乙腈-0.15%磷酸溶液梯度洗脱,检测波长 231、255、326 nm,流速 1.0 mL/min,柱温 30 ℃,进样量20 µL。结果 在上述色谱条件下,芍药苷、原儿茶酸、绿原酸之间分离度良好。芍药苷Y=1546.412 8X+127.075 6(r=0.999 9),线性范围 150.054~1254.50 ng;原儿茶酸 Y=2925.846 8X+2204.107 6(r=0.999 8),线性范围 162.33~1352.75 ng;绿原酸 Y=893.904 5X-261.731 5(r=0.999 4),线性范围 11.43~95.25 ng。3 种成分的平均回收率分别为

97.60%、102.09%、98.52%。结论 该方法操作简单、方便、准确,可为盆炎净胶囊的质量控制提供借鉴。关键词:盆炎净胶囊;芍药苷;原儿茶酸;绿原酸;高效液相色谱法

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.019

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)05-0082-04

Simultaneous Contents Determination of Three Active Ingredients in Penyanjing Capsules

by HPLC YUAN Zhi-ying1, YANG Yan-tao1, LI Rong-dong1, LI Zhe1, OUYANG Ji-de2 (1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. Chenzhou Institute for Food and Drug Control, Chenzhou 423000, China)

Abstract: Objective To establish an HPLC method for simultaneous contents determination of paeoniflorin, protocatechuic acid and chlorogenic acid in Penyanjing Capsule. Methods The chromatographic separation was performed on a SHIMADZU VP-ODS-C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm); the column temperature was maintained at 30 ℃; A gradient elution of acetonitrile-0.15% phosphoric acid aqueous solution was adopted at the flow rate of 1.0 mL/min; The UV detection wavelengths were at 231, 255, and 326 nm; The injection volume was 20 µL. Results Paeoniflorin, protocatechuic acid and chlorogenic acid could be separated efficiently with this condition. The regression equation was Y=1546.412 8X+127.075 6 (r=0.999 9), Y=2925.846 8X+2204.107 6 (r=0.999 8),

Y=893.904 5X-261.731 5 (r=0.999 4), respectively. Paeoniflorin, protocatechuic acid and chlorogenic acid were linear in the range of 150.054–1254.50 ng, 162.33–1352.75 ng, 11.43–95.25 ng, and the average recoveries were

97.60%, 102.09% and 98.52%. Conclusion The method is simple, convenient and accurate, which can be used to the quality control of Penyanjing Capsule.

Key words: Penyanjing Capsule; paeoniflorin; protocatechuic acid; chlorogenic acid; HPLC

盆炎净胶囊是在盆炎净颗粒(卫生部药品标准WS3-B-2387-97)的基础上改变剂型而成,由忍冬藤、蒲公英、鸡血藤、益母草、狗脊、车前草、赤芍、川芎共 8味药组成,具有清热利湿、和血通络、调经止带之功效,适用于湿热下注、白带过多等妇科带下病,

基金项目:湖南省自然科学基金(13JJ5032);湖南省教育厅

优秀青年项目(15B172);湖南省中医药管理局科研项目

(201494);湖南中医药大学青年教师科研基金(2015-13);

湖南中医药大学中药技能大学生创新实验项目(201603)

通讯作者:杨岩涛,E-mail:xdyyt1@163.com

是临床常用中成药之一,疗效确切[1],且未见明显不良反应。但现有质量标准(国家食品药品监督管理局标准 YBZ23722005)较为简单,只有部分药材的薄层定性鉴别,难以整体控制药品质量。芍药苷为赤芍的

定量指标成分[2];君药忍冬藤和蒲公英具有较强的抗

菌作用,其抗菌有效成分以绿原酸为主[3];原儿茶酸是忍冬藤、鸡血藤、狗脊、川芎、车前草等多种药材

中的主要活性成分[4-8]。以上 3 种成分均具有较强的生理活性。采用 HPLC 单独测定芍药苷[9-10]、原儿茶

酸[11]、绿原酸[3]含量的方法均已建立,但尚无同时测定 3种成分含量的方法。因此,为全面控制盆炎净胶

囊质量,提高分析检测效率,本研究尝试建立同时测定芍药苷、原儿茶酸、绿原酸3种主要药效活性物质含量的 HPLC 方法。

1 仪器与试药

岛津 LC-20A 型高效液相色谱仪(日本岛津公司),岛津 SPD-M20A 二极管阵列 DAD 检测器,

SIL-20A 自动进样器,METTLER TOLEDO ML204 电子分析天平(瑞士 METTLER TOLEDO 公司),

KQ-300DE超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。芍药苷对照品(批号 110736-201539)、原儿茶酸对照品(批号 110809- 201205)、绿原酸对照品(批号

110753-201415),中国食品药品检定研究院。盆炎净胶囊(湖南东润联合制药有限公司,批号分别为

20140302、20140415、20151221、20150524、20151213、

20141105、20150126);乙腈、甲醇为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为 SHIMADZU VP-ODS-C18(250 mm×

4.6 mm,5 µm);流动相 A为乙腈,B为 0.15%磷酸溶液,梯度洗脱(见表 1);流速:1.0 mL/min;波长:

231、255、326 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 µL。

2.2 对照品溶液制备

精密称定芍药苷、原儿茶酸和绿原酸对照品适量,置于同一量瓶中,加乙腈溶解稀释,制成每1 mL含芍药苷 250.90 µg、原儿茶酸 270.55 µg 和绿原酸19.05 µg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取盆炎净胶囊内容物约0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇 25 mL,称定质量,超声提取(功率 300 W,频率 40 kHz)30 min,放冷,再称定质量,用50%甲醇补足减失的质量,摇匀,过滤,滤液过微孔滤膜(0.45 µm),取续滤液,即得。

2.4 阴性对照溶液制备

忍冬藤、蒲公英、鸡血藤、狗脊、车前草、赤芍、川芎中均含有芍药苷、原儿茶酸和绿原酸3种有效成 分中的1种或多种,故按处方配比制成只有益母草(缺忍冬藤、蒲公英、鸡血藤、狗脊、车前草、赤芍、川芎)的阴性样品,按“2.3”项下方法制备,即得。

2.5 专属性试验及系统适用性试验

在“2.1”项色谱条件下,混合对照品与供试品溶液中 3种有效成分达到基线分离,色谱图见图1。芍药苷、原儿茶酸、绿原酸各色谱峰与相邻色谱峰的分

离度均>1.5,理论塔板数按芍药苷峰计均>3000。

2.6 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液 300、500、1000、1500、

000、2500 µL,分别置于 10 mL量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀。在上述色谱条件下,吸取各浓度混合对照品溶液20 µL注入高效液相色谱仪,记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标,混合对照品进样量(ng)为横坐标,绘制标准曲线,进行线性回归,得回归方

程:芍药苷(λ=231 nm)Y=1546.412 8X+127.075 6

r=0.999 9),线性范围 150.054~1254.50 ng;原儿

茶酸(λ=255 nm)Y=2925.846 8X+2204.107 6(r=

0.999 8),线性范围 162.33~1352.75 ng;绿原酸(λ=

326 nm)Y=893.904 5X-261.731 5(r=0.999 4),线性范围 11.43~95.25 ng。

2.7 精密度考察

取同一对照品溶液20 µL,连续进样 5次,记录色谱峰峰面积,芍药苷、原儿茶酸和绿原酸色谱峰峰面积的 RSD 分别为 0.7%、0.4%、0.5%,表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

按“2.3”项下方法重复制备 5份同一批号的供试品溶液,分别进行测定,记录色谱峰峰面积,芍药苷、原儿茶酸和绿原酸色谱峰峰面积的 RSD 分别为

1.5%、1.3%、1.9%。表明本方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液20 µL,在上述色谱条件下,分别在 0、2、4、6、12 h进样测定,记录色谱峰峰面积,芍药苷、原儿茶酸和绿原酸色谱峰峰面积的 RSD 分别为 1.3%、1.0%、1.2%。表明 3种有效成分在 12 h内稳定。

2.10 加样回收试验

精密称取已知含量的盆炎净胶囊样品6份(每份内容物 0.1 g),精密加入 2.0 mL混合对照品溶液(相当于芍药苷 501.80 µg、原儿茶酸 541.10 µg、绿原酸

38.10 µg),按“2.3”项下方法制备供试品溶液,并按上述色谱条件进行测定,经计算,加样回收率分别为 97.60%、102.09%、98.52%,RSD 分别为 1.39%、

1.53%、1.12%,表明回收率良好。结果见表 2。

2.11 样品测定

分别精密称取 10 份不同批号的盆炎净胶囊,每份约 0.2 g,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进行测定,各被测组分与共存组分实现基线分离,采用外标法计算样品中各成分的含量,结果见表3。

3讨论

本试验根据芍药苷、原儿茶酸和绿原酸的性质,对供试品溶液的制备方法进行了条件筛选。提取溶剂

比较了纯甲醇、75%甲醇、50%甲醇、95%乙醇、75%

乙醇、50%乙醇、水等的提取效果,结果表明,甲醇提取效果比乙醇好,而甲醇3个浓度的提取效果相近,考虑到成本,选定50%甲醇作为提取溶剂;提取方式比较了超声和回流对提取效果的影响,结果显示,超声提取效率优于回流提取;提取时间比较了超声15、

30、60 min对测定结果的影响,结果显示,超声提取

30、60 min的效果相近,均明显优于15 min 提取效果,综合能量消耗及生产效率等因素,选定提取时间

30 min。因此,最终选择50%甲醇作为提取溶剂,超声提取 30 min制备供试品溶液。

本试验对色谱条件进行优选,采用二极管阵列检测器在波长 200~400 nm范围内扫描,发现芍药苷在

231 nm、原儿茶酸在 255 nm、绿原酸在 326 nm处有最大吸收,为提高分析方法的灵敏度,减少干扰,本研究采用多波长检测方法;考察不同色谱柱 Agilent ZORBAX SB-C18 ( 250 mm × 4.6 mm , 5 µm )、Phenomenex Gemini C18(250 mm×4.6 mm,5 µm)和 SHIMADZU VP-ODS-C18(4.6 mm×250 mm,5 µm)的峰形、柱效和分离度,结果显示,以 SHIMADZU

VP-ODS-C18 为最佳;试验比较了乙腈-水、乙腈0.15%磷酸、甲醇-水、甲醇-0.15%磷酸等不同比例的

流动相系统进行梯度洗脱,结果表明,以乙腈-0.15%磷酸为流动相梯度洗脱,基线平稳,供试品各成分峰保留时间适中,分离度和峰形最佳。最终优选色谱条

件为:SHIMADZU VP-ODS-C18 色谱柱(4.6 mm×

250 mm,5 µm),流动相为乙腈-0.15%磷酸水溶液,梯度洗脱,流速 1.0 mL/min,检测波长分别为 231、

255、326 nm,柱温 30 ℃。在此条件下,基线平稳,分离效果好,因此所建立的方法能同时准确测定芍药苷、原儿茶酸和绿原酸的含量。

对盆炎净胶囊样品的测定结果表明,7 个批次中均含有芍药苷、原儿茶酸和绿原酸,其中芍药苷和原儿茶酸含量比绿原酸高,但不同批次样品的3种成分含量有一定的差异,可能与药材及工艺流程有关,需进一步探讨。本研究建立了同时测定盆炎净胶囊中芍药苷、原儿茶酸和绿原酸含量的分析方法,方法简单、方便、准确,可为盆炎净胶囊、盆炎净颗粒及相关药材的质量控制提供借鉴。

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(收稿日期:2016-06-14)

(修回日期:2016-07-14;编辑:陈静)

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