苏木、川芎对 PG-BE1 干细胞样细胞标志蛋白ABCG2影响的体内研究

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 - 基金项目:国家自然科学基金(81173450)通讯作者:张培彤,E-mail:zhangpeitong@sohu.com

中国中医科学院广安门医院肿瘤科,北京 100053

摘要:目的 体内实验观察不同剂量苏木、川芎对肿瘤干细胞样细胞标志物ABCG2的影响。方法 将无血清培养获得的球细胞接种于裸鼠腋下,将裸鼠随机分为对照组、苏木高剂量组、苏木低剂量组、川芎高剂量组和川芎低剂量组,各给药组给予相应药物灌胃,21 d 后检测抑瘤率,激光共聚焦、Western blot 和 RT-PCR分别检测瘤体 ABCG2 蛋白和 mRNA 表达。结果 经无血清培养获得的球细胞具有无限增殖、抗凋亡、高表

达干细胞标志物等干细胞性能,川芎高、低剂量组可明显抑制瘤体生长(P<0.05),其中川芎低剂量组抑瘤率

明显高于川芎高剂量组,苏木高、低剂量组虽对瘤体有一定的抑制作用,但差异无统计学意义(P>0.05);与

对照组比较,川芎低剂量组可明显抑制ABCG2蛋白的表达,苏木高、低剂量组对ABCG2蛋白表达均无抑制

作用,除川芎低剂量组外,各给药组对ABCG2 mRNA表达均有上调作用。结论 低剂量川芎可能通过抑制肿

瘤干细胞标志物ABCG2蛋白的表达,靶向杀伤肿瘤干细胞。

关键词:苏木;川芎;肿瘤干细胞;ABCG2蛋白DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.014中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)08-0060-06

王耀焓,张培彤,杨栋,韩海英,郭秀伟,祁鑫,张芸

Effects of Sappan Lignum and Chuanxiong Rhizoma on Expression of ABCG2 Protein of PG-BE1 Stem Like Cells in Vivo WANG Yao-han, ZHANG Pei-tong, YANG Dong, HAN Hai-ying, GUO Xiu-wei, QI Xin, ZHANG Yun (Department of Oncology, Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100053, China)

Abstract: Objective To observe the effects of different doses of Sappan Lignum and Chuanxiong Rhizoma on tumor stem cells marker ABCG2 in vivo. Methods Sphere cells obtained from serum culture were inoculated in nude mouse armpit, which were randomly divided into 5 groups: control group, Sappan Lignum high- and low-dose groups, and Chuanxiong Rhizoma high- and low-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage. 21 days later, inhibition tumor rate and ABCG2 protein and mRNA expression were detected with confocal microscope, Western blot, and RT-PCR. Results The sphere cells obtained from serum free culture had the abilities of cancer stem cells, such as proliferation, anti-aptosis and high expression of cancer stem cells markers. Chuanxiong Rhizoma high- and low-dose groups could inhibit tumor growth (P<0.05), and the inhibitory rate of Chuanxiong Rhizoma low-dose group was higher than the Chuanxiong Rhizoma high-dose group. Sappan Lignum high- and low-dose groups inhibited tumor growth without statistical significiance (P>0.05). Compared with the control group, Chuanxiong Rhizoma low-dose group could significantly inhibit the expression of resistant protein of ABCG2. Sappan Lignum high- and low-dose groups could not inhibit the protein expression of ABCG2. Each medication group up-regulated the mRNA expression of ABCG2 except for Chuanxiong Rhizoma low-dose group.

Conclusion Low dose of Chuanxiong Rhizoma can inhibit the expression of ABCG2 protein levels, which can be the targeting killer for cancer stem cells.

Key words: Sappan Lignum; Chuanxiong Rhizoma; cancer stem cells; ABCG2 protein

化疗在改善肿瘤患者生存质量、提高患者生存率方面起到重要作用。然而,化疗耐药的存在一直制约着临床疗效的发挥。有研究显示,经化疗后再复发或

发生远处转移的乳腺癌患者,大约药引起的[1]。因此,寻找可以增强化疗敏感性的药物40%是由于化疗耐是目前面临的挑战。近几年来,肿瘤干细胞理论的提出对化疗耐药的治疗提出了新的理念。该理论认为,肿瘤干细胞具有自我更新、多向分化、化疗耐药等性能,是肿瘤复发及转移的主要原因。课题组前期研究表明,苏木、川芎嗪对肿瘤转移具有明显的抑制作用[2-3]。体内实验显示,苏木、鸡血藤及二者联合顺

铂可以将肿瘤细胞阻滞在G0/G1 期,并可抑制与细胞增殖相关的蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)、低氧诱导

因子-1α ( HIF-1α )表达,另外对 P16-Cyclin D1CDK4-RB途径也具有调节作用,三者相互作用共同阻滞肿瘤的发生发展[4-5]。基于以上研究基础,我们选用川芎、苏木作为活血的代表药,体内实验观察不同剂量苏木、川芎对肺癌干细胞样细胞的干预作用。

ABCG2 蛋白是目前比较公认的肿瘤干细胞标志物之一。因此,本实验主要研究在体内环境中不同剂量川芎、苏木对 PG-BE1 干细胞样细胞标志蛋白 ABCG2的影响。

1 实验材料

1.1 动物BALB/c-nu 裸鼠,4~6 周龄,体质量(16±2)g,雌雄各半,北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号 SYXK(京)2013-0032,饲养于北京大学医学部实验动物中心。1.2 细胞系高转移性人巨细胞肺癌细胞 PG-BE1,中国中医科学院广安门医院肿瘤研究室。1.3 药物苏木、川芎,康美药业股份有限公司;顺铂注射液,齐鲁制药(海南)有限公司,批号20120724。1.4 主要试剂与仪器Human FGF-basic(美国 Pero Tech),Human EGF (美国 Pero Tech),B27 Supplement(50×,美国Gibco),Tripsin inhibition from Glycine max(soybea,

美国 Sigma),Anti-BCRP/ABCG2 抗体(美国Abcam),

CCK8 试剂盒(日本同人),ANNEXIN V(美国 BD),

ABCG2 Gene、Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG

(H+L)、TRIzol Reagent(美国 Life Technologies)。高速冷冻离心机(美国 Sigma),NanoDrop 2000 超微量分光光度计(美国 Thermo Scientific),PROGENE PCR 扩增仪(英国 Techene),Applied Biosysterns 7500 RT-PCR Systems(美国 ABI),DYY-12 型电脑三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂),ChemiDoc XRS 凝胶成

像系统(美国显微镜(德国Bio-Rad),ZEISS Zeiss),水平电泳槽(美国LSM710 激光共聚焦Bio-Rad)。2 2.1实验方法药物制备、分组及给药

15 g,双蒸水浸泡 30 min,煎煮

2次,将取苏木、川芎各2次煎剂浓缩至60 mL,浓度 0.25 g/mL,为高剂量药液。另取苏木、川芎各5 g,双蒸水浸泡30 min,

将 2次煎剂浓缩至 100 mL,浓度 0.05 g/mL,为低剂量 4 ℃冰箱保存备用。将裸鼠随机分为对照组、川芎低剂量组、川芎高剂量组、苏木高剂量组、苏木低剂量组,每组5只,苏木低、高剂量和川芎低、高剂量小鼠给药剂量相当于成人(体质量 60 kg)临床给药量 10、30 倍(成人每日临床给药量为苏木、川芎各

10 g)。小鼠给药体积为 200 μL/次,1 次/d。2.2 干细胞样细胞分选常规复苏、培养PG-BE1细胞,待其生长至70%~ 80%时,胰酶消化成单个细胞,PBS清洗 2次,重悬于含 0.02 μg/mL EGF、0.02 μg/mL bFGF、5 μg/mL 胰岛素、2%B27、4%BSA 的 DMEM/F-12 的培养基,调整细胞浓度 2×104/孔,接种于低黏附 6 孔板,待细胞成球且折光率变低时收集 PG-BE1 球细胞,离心、胰酶消化,1 mg/mL 大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化,重悬于上述完全培养基 DMEM/F-12 中。使用传代至第 3 代的 PG-BE1 球细胞。2.3 干细胞样细胞鉴定2.3.1 CCK-8检测细胞增殖 分别收集PG-BE1贴壁细胞及第 3 代 PG-BE1 球细胞,接种于 96 孔板, 1000 个/孔,分为 3、4、5、6、7d 组,每组5个复孔。分别于第3、4、5、6、7 日时加入Cell Counting Kit-8细胞增殖检测试剂,10 μL/100 μL培养基,酶标仪检测吸光度(OD)。

2.3.2 AV/PI检测细胞凋亡 分别收集PG-BE1贴壁

细胞及第3 代 PG-BE1 球细胞,预冷的PBS 清洗细胞

2次,并重悬于 1×Binding Buffer,调整细胞浓度至

1×106/mL。取 100 μL 上述细胞悬液置于流式管中,

加 5 μL FITC Annexin V及 5 μL PI。轻柔震荡细胞,

室温(25 ℃)避光孵育 15 min。每管加 400 μL

1×Binding Buffer,流式细胞仪检测。2.3.3 免疫荧光检测细胞 ABCG2 表达 分别收集

PG-BE1 贴壁细胞及第 3 代 PG-BE1 球细胞,调整细胞浓度至 1×105/mL,接种于 96 孔板。24 h后,每孔依次加入 4%多聚甲醛固定,0.1%Triton-X 透膜,免疫荧光封闭液室温封闭1 h,一抗 4 ℃孵育过夜,荧光二抗避光孵育1h,滴加 DAPI 避光孵育 5 min,最

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