连翘、防风和辛夷混合挥发油提取及包合工艺研究

2017-08-15 - 通讯作者：吴清，E-mail：qwu@vip.sina.com

于竞新1，李冰韶 1，邱玥 1，张晓阳 2，连增林 3，吴清 1

1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.北京协和医院中医科，北京 100730；

3.北京亦创生物技术产业研究院生物中药技术研究所，北京 101111

摘要：目的筛选连翘、防风和辛夷混合的挥发油提取及 β-环糊精包合的最佳工艺。方法以混合挥发油收取量为指标，单因素试验考察混合挥发油的最优提取工艺；选用饱和水溶液法，以混合挥发油包合率为指标，正交试验设计考察混合挥发油与 β-环糊精投料比、包合时间和包合温度对包合工艺的影响；通过 X 射线衍射法、红外光谱法以及扫描电镜法对包合物进行验证。结果混合挥发油提取最优工艺为：加10倍量水，浸泡3h，粉碎成细粉，提取5 h。最佳包合工艺为：挥发油（mL）与β-环糊精（g）比例为1∶10，包合温度为 50 ℃，包合时间为2h。X射线衍射法、红外光谱法及扫描电镜均表明混合挥发油包合物构建相对稳定。结论优选的提取和包合工艺稳定可行，为进一步制剂开发提供了研究基础。关键词：连翘；防风；辛夷；混合挥发油；β-环糊精；包合工艺

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.018

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2017)08-0080-05

Study on Extraction and Inclusion Processes of Mixed Volatile Oils from Forsythiae Fructus,

Saposhnikoviae Radix and Magnoliae Flos YU Jing-xin1, LI Bing-shao1, QIU Yue1, ZHANG Xiao-yang2, LIAN Zeng-lin3, WU Qing1 (1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China; 2. TCM Department, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730, China; 3. TCM Biotechnology Institute of Beijing Yichuang Biotechnology Academy, Beijing 101111, China)

Abstract: Objective To optimize the extraction process of mixed volatile oil from Forsythiae Fructus, Saposhnikoviae Radix and Magnoliae Flos and inclusion process of β-cyclodextrin (β-CD). Methods With yield ratio of volatile oil as evaluation index, single factor experiments were used to study the extraction process of volatile oil; saturated aqueous solution was used, with inclusion rate of volatile oil as index, and orthogonal design was adopted to examine effects of charge ratio of volatile oil and β-CD, inclusion temperature and inclusion time on the inclusion process; X-ray scattering technique, infrared spectroscopy and scanning electron microscopy were used to characterize the inclusion compound. Results The optimum extraction process of volatile oil was soaking fine powder extracted 5 hours with 10 folds the amount of water. The optimum conditions of inclusion process were as follows: mixed ratio of volatile oil (mL) and β-CD (g) was 1:10; inclusion temperature was 50 ℃; the inclusion time was 2 h. X-ray scattering technique, infrared spectroscopy and scanning electron microscopy proved the inclusion compound had been formed. Conclusion Optimum extraction and inclusion processes are stable and feasible, and can provide research foundation for further research and development of preparation.

Key words: Forsythiae Fructus; Saposhnikoviae Radix; Magnoliae Flos; mixed volatile oil; β-cyclodextrin; inclusion process

祛风胜湿方是北京协和医院中医科治疗变应性鼻炎的临床经验方，其基于中医风药理论，以祛风、疏风、散风药物为主，辅以开窍清解之品立法配伍而成。全方温清并举、疏风散邪、祛风胜湿，对变应性鼻炎具有良好的治疗作用。该方由连翘、防风和辛夷等药组成，连翘、防风和辛夷均含挥发油且具有抗炎、抗过敏作用。荆防挥发油对大鼠弗氏完全佐剂所致的关节炎肿胀、小鼠被动异种皮肤过敏反应抑制作用明

显[1]。辛夷挥发油能够调节变态反应性鼻炎豚鼠外周血中 Th细胞免疫，从而维持 Th1/Th2 的动态平衡[2]。连翘挥发油有明显抑制大鼠角叉菜胶性足肿胀和大

鼠棉球肉芽形成的作用[3]。3 味药共同使用，可以共

同发挥对变应性鼻炎的治疗作用。因混合挥发油的水溶性、稳定性及具有刺激性气味等问题，本研究将连翘、防风和辛夷提取挥发油后，采用β-环糊精（β-CD）包合制备包合物，在改善上述问题的同时发挥其药效，为其制剂研发提供基础，并通过X射线衍射法、红外光谱法及扫描电镜法对包合物进行验证，以确定包合物的成型。

1 仪器与试药

98-1-B电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；SARTORIUS分析天平（北京赛多利斯仪器系

统有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器

（北京科伟永兴仪器有限公司）；XD-3X 射线衍射仪

（北京普析通用仪器有限责任公司）；Quanta250 扫描电子显微镜（捷克 FEI）；NEXUS 傅立叶变换红外光谱仪（Thermo Nicolet）；高速万能粉碎机 FW100，真空干燥箱（上海博讯实业有限公司）；循环水式多用

真空泵（上海知信实验仪器技术有限公司）；CX-300型超声波清洗器（北京医疗设备厂）。

连翘饮片、防风饮片和辛夷饮片均购于安国萌露饮片销售有限公司，经检验符合 2015 年版《中华人民共和国药典》标准；β-环糊精（β-CD，天津市光复精细化工研究所，分析纯），无水乙醇（北京化工厂，分析纯），水为超纯水。

2 方法与结果 2.1 混合挥发油提取工艺

按处方比例称取4倍处方量饮片，即连翘48 g、防风和辛夷各 40 g，按 2015 年版《中华人民共和国

药典》（四部）2204 通则挥发油测定法甲法提取，收集挥发油，无水硫酸钠脱水，连翘、防风、辛夷混合油为淡黄色液体，密闭，置4 ℃冷藏备用。

采用单因素试验方法对连翘、防风和辛夷的混合挥发油提取工艺进行考察，分别选取浸泡与否、粉碎粒度、提取时间和加水倍量4个因素，以混合挥发油收取量为指标进行评价。

2.1.1 浸泡与否称取连翘48 g、防风和辛夷各40 g，加 10 倍量水浸泡，以润湿为标准（经前期试验，以浸泡 3h为宜），之后进行水蒸汽蒸馏提取，至挥发油量不再增加，读取挥发油量，结果见表 1。可见，浸泡与否影响出油速度，浸泡后混合挥发油能更快提取完全，因而选取浸泡进行提取。

2.1.2 提取时间称取连翘48 g、防风和辛夷各40 g，加 10倍量水浸泡后提取，蒸馏至挥发油量不再增加，读取挥发油量，结果提取4、5、6、7、8h 的挥发油收取量依次为 1.67、1.73、1.73、1.73、1.73 mL。可见，当提取5 h后，混合挥发油的收取量不再增加，因此选取5 h作为提取时间。

2.1.3 粉碎粒度称取连翘48 g、防风和辛夷各40 g，加 10 倍量水浸泡，分别以不粉碎、粗粉（10目）和

细粉（80目）进行提取，至挥发油量不再增加，读取挥发油量，结果见表 2。可见，粉碎粒度对混合挥发

油提取有一定影响，药材粉碎成细粉（80目）与不粉

碎和粗粉（10目）比较，提取时间短且混合挥发油提取量最多。因此，选取细粉作为最佳粉碎粒度。

2.1.4 加水倍量称取连翘48 g、防风和辛夷各40 g，

粉碎成细粉（80 目），分别加入 8、10、12、15 倍量水浸泡后提取，至挥发油量不再增加，读取挥发油量，结果见表 3。可见，加水倍量对混合挥发油提取有一定影响，但从10倍量开始，混合挥发油的提取量5 h后基本不再增加，且提取量差异不大，故综合考虑选用 10倍量水提取。 2.1.5 验证试验综合以上单因素试验结果，最终选取水蒸汽蒸馏提取混合挥发油的最优工艺为：加10倍量水，浸泡3 h，粉碎成细粉，提取5 h。并对最优工艺进行验证试验，结果见表 4。可见，此工艺验证结果与之前试验结果一致，说明优选的提取工艺合理、可行。

2.2 混合挥发油β-环糊精包合工艺

2.2.1 空白回收率测定精密量取混合挥发油1 mL，置 500 mL圆底烧瓶中，加入蒸馏水250 mL，按 2015

年版《中华人民共和国药典》（四部）2204 通则挥发油测定法甲法测定，计算空白回收率（挥发油收取

量÷挥发油加入量×100%）。结果挥发油的空白回收率为 94%。

2.2.2 正交试验设计选择饱和水溶液法对混合挥发油进行包合。选取包合温度、包合时间、混合挥发油与 β-CD 比例为考察因素，每个因素3个水平（见表5），以混合挥发油包合率（包合物回收油量÷挥发

油加入量×空白回收率×100%）为考察指标，采用

L9（34）正交设计进行试验。

2.2.3 包合物制备按正交试验安排进行试验，取一定量的 β-CD置锥形瓶中，加入蒸馏水80 mL，加热使溶解，制成 β-CD 饱和溶液，冷却至相应温度并置于磁力搅拌器上恒温，加入1 mL混合挥发油与等量无水乙醇的混合溶液，恒温搅拌至规定时间，冷却至室温，放入冰箱冷藏24 h，抽滤，包合物用适量水洗涤，再用5 mL无水乙醇洗涤，包合物置真空干燥箱中干燥3h，即得。

2.2.4 包合率的测定取收集的干燥包合物，精密称定，置 500 mL圆底烧瓶中，加入250 mL蒸馏水，连接挥发油提取装置，按 2015 年版《中华人民共和

国药典》（四部）2204 通则挥发油测定法甲法提取挥发油，保持微沸 5 h，至油量不再增加，收集混合挥发油，计算混合挥发油的包合率，结果见表6、表 7。

2.2.5 正交试验结果与分析直观分析结果显示，最优包合工艺为A3B2C2。方差分析结果表明，各因素对挥发油包合率均无显著影响。因此，确定最优包合工艺为 A3B2C2，即挥发油（mL）与 β-CD（g）比例为1∶10、包合温度为 50 ℃、包合时间为2 h。

2.2.6 包合工艺验证试验按照直观分析的最优包合工艺条件，进行3批验证试验，结果见表8。由验证结果可知，混合挥发油 β-CD 包合工艺所得包合率

RSD＜2%，表明确定的包合工艺合理、稳定、可行。

2.3 包合物验证

2.3.1 X 射线衍射鉴定采用 X 射线衍射鉴定进行表征，鉴定包合物的包合情况。取 β-CD、混合挥发油 β-CD 包合物以及 β-CD 和混合挥发油的物理混合物，分别进行X射线衍射试验，以扫描角度为横坐标，衍射强度为纵坐标，采用 Origin 软件绘制 X 射线衍射图，结果见图1。可见，β-CD、包合物和物理混合物的特征峰存在明显区别，包合物在2θ 为5°～8°、

10°～12°、16°～26°、16°～26°左右产生新的吸收峰，在 8°～10°、12°～14°、26°～28°、

34°～36°左右的吸收峰消失或减弱。因此，可以认为混合挥发油已经进入 β-CD 空腔结构内，形成挥发油包合物。

2.3.2 红外光谱法鉴定在波长 400～4000 cm-1 范围内对混合挥发油、β-CD、混合挥发油 β-CD 包合物、混合挥发油与 β-CD 的物理混合物进行红外光谱扫描。采用 KBr 压片法，将一定量 β-CD、包合物、物理混合物与KBr混合研磨后压成薄片（每2 mg 样品加 200 mg 干燥 KBr粉末）。混合挥发油则搭载于KBr所制薄片上。先使用空白KBr薄片作为背景采集，然后进行样品红外光谱扫描，分辨率为 8，扫描次数为60次，比较红外吸收区吸收峰的变化，结果见图2。

β-CD 红外光谱图中，在 3385.70 cm-1处的吸收峰是-OH伸缩振动产生的，在 2925.02 cm-1处的吸收峰

是-CH2-的 C-H伸缩振动产生的，在 1651.94 cm-1处的吸收峰是 H-O-H 弯曲振动产生的，在 1157.56 cm-1 处的吸收峰是C-O伸缩振动产生的，在 1030.00 cm-1 处的吸收峰是 C-O-C伸缩振动产生的。混合挥发油红外光谱图中，在 2961.48 cm-1处的吸收峰是=CH2伸缩振动产生的，在 2927.45 cm-1处的吸收峰是-CH2-的 C-H伸缩振动产生的，在 1647.27 cm-1处的吸收峰是C=C伸缩振动产生的，在 1452.74 cm-1处和 1377.13 cm-1

处的吸收峰是-CH2-弯曲振动产生的，在 1234.96 cm-1处的吸收峰是CH2=CH-振动产生的。物理混合物的红外光谱约为 β-CD 和混合挥发油吸收峰的叠加，而包合物的红外光谱与挥发油完全不同。在包合物的红外光谱图中，混合挥发油在 2961.48、1647.27、1452.74、

1234.96 cm-1 处的吸收峰均消失，而且与 β-CD 在

3385.70、1651.94 cm-1 处相对应的吸收峰移到了

3375.41、1637.58 cm-1，同时在 1333.52、1079.74 cm-1处出现了新的吸收峰。以上说明混合挥发油与 β-CD相互作用形成了新的物象，证实包合物已经形成。

2.3.3 扫描电镜鉴定以 β-CD、混合挥发油 β-CD包合物、混合挥发油与 β-CD 的物理混合物为样品，分别置于双面胶带上并粘在样品台上，于真空条件下喷金，扫描电镜观察样品的表观形态，结果见图3。

由扫描电镜结果可知，β-CD 为板状晶体，表面较为光滑；物理混合物类似于 β-CD，物理混合物表面附载着大量的油滴，且可观察到油附着于 β-CD 的晶体上；包合物为结晶状物质，其晶体的形状和大小不同于 β-CD 和物理混合物，晶体体积比 β-CD 和物理混合物小，而且表面几乎没有油滴附着。上述结果可证明混合挥发油已经进入 β-CD 的空腔内形成了新物相。

3 讨论

本研究选取 β-CD 对祛风胜湿方中连翘、防风和辛夷混合挥发油进行包合工艺研究，是考虑到 β-CD本身无不良反应，且在中药挥发油制剂中应用广

泛[4-7]。但目前对此 3 种药物的混合挥发油包合工艺尚无相关报道，故综合文献所报道的 β-CD 中药挥发油包合工艺及包合物验证试验方法，选择饱和水溶液法制备混合挥发油包合物，并通过X射线衍射法、红外光谱法以及扫描电镜法对混合挥发油包合物进行

验证[8-10]，以确保包合物制备方法稳定可行。最终，本试验制备出较为稳定的混合挥发油 β-CD 包合物，使液体药物粉末化，增强了混合挥发油的水溶性，提高了其稳定性，掩盖了药物的刺激性气味，为日后制剂的制备提供了研究基础。

但有文献报道粉碎与否对于挥发油提取的规模

化生产的顾虑[11]，也有文献报道将药材粉碎成细粉进

行挥发油提取[5]。本试验选取细粉作为粉碎粒度的最

优工艺，主要有以下2个原因：首先，有文献报道粉

碎药材对挥发油提取效果更好[12]。本试验所用 3 味药，连翘入药部位为果实，防风入药部位为根，辛夷

入药部位为花蕾[13]，其中连翘果实和辛夷花蕾均有较为坚硬的外壳，而防风的根也较为坚实。因此，将三者粉碎有助于混合挥发油提取，不仅能够增加混合挥发油提取量，还可缩短提取时间，有利于提高规模化生产效率及节省能源消耗。且试验结果也证实粉碎较不粉碎混合挥发油提取效果佳，粉碎成细粉提取效果更佳。其次，将3味药材粉碎成细粉进行后续提取，在提取过程中并未发生糊化、爆沸及过筛困难等问题

而致提取不能顺利进行[14]。故认为可尝试根据试验最优结果，将连翘、防风和辛夷粉碎成细粉，进行混合挥发油的规模化提取。

连翘、防风和辛夷的混合挥发油成分较为复杂，单一指标包合率不足以全面评价包合物的质量，今后还应增加新的指标测定，如混合挥发油成分在包合前后的变化及相应质量评价，从而制定更完善的标准控制包合物的质量。

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