HPLC同时测定三果汤水提物中没食子酸、柯里拉京及鞣花酸含量

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 - 通讯作者:范源,E-mail:1647909799@qq.com

李斌1,李鑫 2,范源 1

1.云南中医学院中药学院,云南 昆明 650200;

2.湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室,湖南 长沙 410007

摘要:目的 建立 HPLC 同时测定三果汤水提物中没食子酸、柯里拉京及鞣花酸含量的方法。方法 采用 Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 µm),流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱,检测波长为 260 nm,柱温 30 ℃,流速为 1.0 mL/min。结果 没食子酸、柯里拉京及鞣花酸3种成分有较好的基线分离,且峰形较好,分别在 0.174~2.61 µg、0.04~0.60 µg、0.052~0.78 µg范围内线性关系良好;平均加样回收率分别为 99.98%、99.81%、100.12%,RSD 均小于 2.0%。结论 本方法快速、准确、重复性好,可为三果汤水提物的质量控制提供依据。关键词:三果汤水提物;高效液相色谱法;没食子酸;柯里拉京;鞣花酸

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.019

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)09-0076-04 Content Determination of Gallic Acid, Corilagin and Ellagic Acid in Aqueous Extract from

Sanguo Decoction by HPLC LI Bin1, LI Xin2, FAN Yuan1 (1. School of Chinese Medicine, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650200, China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory of Diagnostics in Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China)

Abstract: Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of contents of gallic acid, corilagin and ellagic acid in aqueous extract from Sanguo Decoction. Methods The analysis was carried out on an Agilent C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm), and the mobile phase was composed of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid aqueous with gradient elution. The detection wavelength was 260 nm. The flow rate was 1.0 mL/min at column temperature of 30 ℃. Results Gallic acid, corilagin and ellagic acid were completely separated and the peak shape was good. It showed a good linearity in the concentration range of 0.174–2.61 µg, 0.04–0.60 µg, and 0.052–0.78 µg, respectively. The average recoveries of gallic acid, corilagin and ellagic acid were 99.98%, 99.81% and 100.12%, respectively. The RSD were less than 2.0%. Conclusion This method is rapid, accurate and repeatable, which can provide references for the quality control of Sanguo Decoction.

Key words: aqueous extract from Sanguo Decoction; HPLC; gallic acid; corilagin; ellagic acid

三果汤由诃子、毛诃子、余甘子3味药组成,为藏医学的重要基础方,具有清热、调和气血、化解坏

血功效[1]。《四部医典》称其“主治瘟疫,紊乱热症,促使热症成型”。研究表明,三果汤主要含鞣质酚酸类成分,具有抗氧化、降糖调脂、抗病原微生物、抗

炎、抗肿瘤等多种药理作用[2-3]。诃子与毛诃子均为使君子科植物的干燥成熟果实。有报道,二者活性成分均为以没食子酸为主的鞣质类物质,并对诃子中没

食子酸含量进行了测定[4-7]。而鞣花酸则在植物界中 广泛分布,在诃子中含量较高,有报道将鞣花酸作为

诃子的质控指标[8-9]。余甘子为大戟科叶下珠属植物

的干燥成熟果实,有机酸类物质是其主要成分[10-12],

2015年版《中华人民共和国药典》规定以没食子酸为指标评价余甘子质量。目前有较多报道增加了多酚类

成分柯里拉京作为余甘子的质控指标[13]。中药及其制剂质量标准的研究与建立已由单一成分向多种成分甚至有效物质群发展。在现有文献报道中,三果汤的质控多以单一没食子酸或没食子酸和

鞣花酸为指标,不能充分反应三果汤的内在质量[2,14]。本研究选取三果汤中3味药物的共同药效成分没食子

酸、诃子中的鞣花酸及余甘子中的柯里拉京为指标,建立 HPLC同时测定三果汤水提物中没食子酸、柯里拉京及鞣花酸含量的方法,为进一步完善三果汤的质量控制标准提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国 Agilent 公司),包括四元梯度泵、真空在线脱气机、自动进样器、柱温箱、VWD 检测器和 Agilent 色谱工作站;

YL-080ST 型超声清洗机(深圳仁义行商贸有限公

司);EYEL4型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司);

FA1004N 型 1/1万电子分析天平(上海菁海仪器有限公司)。

没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院,批号 201404)、柯里拉京对照品(四川维克奇生物科技有限公司,批号 151125)、鞣花酸对照品(四川维克奇生物科技有限公司,批号140812);诃子、毛诃子、余甘子(产地云南,批号分别为 20160606、20160607,

20160722、20160723、20160724、20160725),购自安国中药材市场,经云南中医学院中药学院范源教授鉴定分别为使君子科诃子、毛诃子的干燥成熟果实及大戟科余甘子的干燥成熟果实;乙腈为色谱纯(德国Merck公司),纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司),其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 混合对照品溶液制备

分别精密称取没食子酸、柯里拉京、鞣花酸对照品 8.7、2.0、2.6 mg,置于 50 mL量瓶中,加二甲基亚砜溶解,超声5 min,取出,定容至刻度,过 0.45 µm微孔滤膜,即得没食子酸、柯里拉京、鞣花酸浓度分别为 174、40、52 µg/mL 的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

取诃子、毛诃子、余甘子(去核)各5 g,捣碎,加入 100 mL蒸馏水,浸泡30 min,煎煮 3次,每次20 min,过滤,合并滤液,于旋转蒸发仪上浓缩成含原药材 0.5 g/mL的三果汤水提物,冷藏,备用。精密吸取三果汤水提物1 mL,置于 50 mL量瓶中,加 50%甲醇溶解并定容至刻度,过0.45 µm微孔滤膜,即得。

2.3 色谱条件

色谱柱为 Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×

250 mm,5 µm),流动相 A为 0.1%-磷酸水溶液、B

为乙腈,梯度洗脱(0~6 min,3%~10%B;6~15 min,

10%~15%B;15~18 min,15%~20%B;18~25 min,

20%~42%B;25~26 min,42%~55%B;26~30 min,

55%B),流速为 1.0 mL/min,检测波长为 260 nm[10], 柱温为 30 ℃,进样量为 10 µL。在此色谱条件下,样品中没食子酸、柯里拉京和鞣花酸的色谱峰与其他相邻峰的分离度均大于 1.5,且无阴性干扰,理论塔板数按没食子酸峰计算均不低于5000,色谱图见图1。

2.4 线性关系考察

取混合对照品溶液,在“2.3”项色谱条件下,分别进样 1、3、5、7、10、15 µL进行测定,记录峰面积,以进样量为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,进行线性回归,得3种成分的回归方程,见表1。

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 µL,在“2.3”项色谱条件下连续进样6次进行分析,记录峰面积,结果种成分峰面积的RSD 分别为 2.14%、1.54%、2.81%,表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验

取同一供试品溶液,室温放置,于0、2、4、6、12 h分别进样 10 µL进行测定,记录峰面积,结果没食子酸、柯里拉京与鞣花酸峰面积的 RSD 分别为 2.61%、2.52%、1.13%,表明室温条件下供试品溶液在 12 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批诃子、毛诃子、余甘子(去核),按“2.2”项下方法制备供试品溶液,共6份,分别进样10 µL

进行测定,记录样品中3种有效成分的峰面积,结果没食子酸、柯里拉京及鞣花酸峰面积的 RSD 分别为1.46%、0.88%、1.59%,表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取原药材含量为0.5 g/mL的三果汤水提物0.5 mL,精密吸取 9 份,置于 50 mL 量瓶中,分别精密加入

80%、100%、120%已知含量混合对照品溶液,平行 3份,加甲醇溶解,定容至刻度,过0.45 µm微孔滤膜,分别进样 10 µL进行测定,记录峰面积,计算加样回收率,结果见表2。其中,供试品溶液以10 µL 进样分析,测得没食子酸、柯里拉京和鞣花酸的量分别为

1.574~1.921 µg、0.365~0.457 µg、0.462~0.579 µg,均在标准曲线线性范围内。

2.9 样品测定

取诃子、毛诃子及余甘子(去核)各 5 g,共 6

批,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,每批平行测

3份,分别进样10 µL进行测定分析,并分别计算含原药材 0.5 g/mL的三果汤水提物中没食子酸、柯里拉京及鞣花酸的含量,结果见表3。

3 讨论

藏药三果汤由诃子、毛诃子及余甘子按 1∶1∶1比例组成,现主要用于治疗高原红细胞增多症、高血压及心血管疾病等。目前尚未见对三果汤水提物中化学成分进行定量测定的报道。鞣质酚酸类物质为三果汤的主要药效成分,其极性大、易溶于水,采用水煎煮方式能较大程度提取有效成分,且具有经济易得、安全性高的特点。另一方面,鉴于三果汤良好的临床疗效,在藏医药体系中有很高的使用频率,为研究其发挥作用的物质基础,本试验采用HPLC 对用于药效学研究的水提液中没食子酸、柯里拉京及鞣花酸3种成分进行定量测定。

本试验考察了 50%、80%、100%甲醇及 100%乙腈配制的供试品溶液,结果显示,样品在50%甲醇中可完全溶解,且分离度和峰形最佳。此外,鞣花酸微溶于水、醇,用不同浓度的甲醇、乙腈均不能使鞣花酸完全溶解,而用二甲基亚砜作溶媒配制混合对照品溶液进行测定,鞣花酸出峰良好。

本试验比较分析了乙腈(甲醇)-水、乙腈(甲

醇)-0.1%磷酸、乙腈(甲醇)-0.2%磷酸等流动相系

统,结果表明,乙腈-0.1%磷酸水溶液作流动相进行梯度洗脱时,分离度较好且峰形尖锐。另外,还对柱

温(25、30、35、40 ℃)和流速(0.85、1.0、1.25、

1.5 mL/min)进行了优化,结果显示,柱温 30~40 ℃、流速 1.0~1.25 mL/min 时分离效果较佳,因此选择柱温 30 ℃、流速 1.0 mL/min。

本研究以没食子酸、柯里拉京与鞣花酸为三果汤水提物质量控制指标,建立了HPLC同时测定三果汤

水提物中没食子酸、柯里拉京及鞣花酸含量的方法。总之,该方法精密性、稳定性、重复性均良好,结果准确,可有效控制三果汤水提物的内在质量,为藏药三果汤的药效物质基础研究提供了依据。

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(收稿日期:2016-12-26)

(修回日期:2017-01-09;编辑:陈静)

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